SMLM resuelto temporalmente (con un gran cambio de PAR) permitió la visualización de la formación y migración dinámica de grupos de HA en una célula viva

Jul 23, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12561 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Las propiedades de parpadeo de una sola molécula son fundamentales para la microscopía de localización de una sola molécula (SMLM). Normalmente, las técnicas SMLM implican registrar varios fotogramas de puntos brillantes de moléculas individuales limitados por difracción con un tiempo de exposición del detector cercano al período de parpadeo. Esto establece un límite en la resolución temporal de SMLM a unas pocas decenas de milisegundos. Al darnos cuenta de que una fracción sustancial de moléculas individuales emite fotones en escalas de tiempo mucho más cortas que el período de parpadeo promedio, proponemos acelerar la recopilación de datos para capturar estos emisores rápidos. Aquí, presentamos un método SMLM (shortSMLM) basado en exposición corta impulsado por un detector sCMOS para comprender eventos dinámicos (tanto a nivel de molécula única como de conjunto). La técnica se demuestra en un modelo de enfermedad de influenza-A, donde las células NIH3T3 (tanto fijadas como vivas) se transfectaron con ADN plasmídico Dendra2-HA. El análisis muestra una mejora de 2,76 veces en la resolución temporal que viene con un sacrificio en la resolución espacial y un cambio de resolución de partículas PAR-shift (en términos de precisión de localización) de \(\sim\) 11,82 nm en comparación con el SMLM estándar. Visualizamos la formación dinámica de grupos de HA en células transfectadas después de 24 h de transfección de ADN. Se observa que una reducción en la resolución espacial no altera sustancialmente las características del grupo (densidad del grupo, \(\#\) moléculas/grupo, dispersión del grupo, etc.) y, de hecho, preserva las características críticas. Además, las imágenes de lapso de tiempo revelan la formación dinámica y la migración de grupos de hemaglutinina (HA) en una célula viva. Esto sugiere que \(short-SMLM\) el uso de un detector sCMOS sincronizado de alta QE (operado en tiempos de exposición cortos) es excelente para estudiar la dinámica temporal en el sistema celular.

Las técnicas estándar de microscopía de localización de molécula única (SMLM) (fPALM1, STORM2, PALM3, IML-SPIM4, MINFLUX5,6, dSTORM7, SOFI8, ROSE9, SMILE10,11, POSSIBLE12 y variantes13,14,15,16,17) suelen adquirir varios miles (\(> 10^{3}\) ) imágenes de moléculas individuales para reconstruir una única imagen superresuelta. Esto representa un tiempo de adquisición considerable que los tiempos habituales de exposición y lectura de la cámara. Para acelerar la resolución temporal general, es necesario acelerar la adquisición de datos. Sin embargo, existe un límite en la resolución temporal debido al tiempo del ciclo de fluorescencia de una molécula18. En los últimos tiempos, se han realizado pocos estudios utilizando moléculas de parpadeo rápido, alta intensidad de excitación, estados oscuros y cámara sCMOS19,20,21,22,23. En otros estudios, la reducción del tiempo de adquisición mediante técnicas computacionales ha resultado prometedora. Otras técnicas que incluyen el uso de motores informáticos rápidos (FPGA-GPU y CUDA) junto con inteligencia artificial han mostrado un gran potencial en SMLM24,25,26,27. Aunque estas técnicas son útiles, son propensas al fotoblanqueo. Aquí, analizamos la adquisición rápida de datos impulsada por tecnología sCMOS avanzada para capturar proteínas fluorescentes de parpadeo rápido (Dendra2). Avilov et al28 estudian en detalle el comportamiento de parpadeo de Dendra2 junto con los tiempos de encendido/apagado. Se espera que las técnicas de adquisición rápida junto con motores de computación veloces sean una combinación formidable y es más probable que permitan obtener imágenes de súper resolución en tiempo real.

En los últimos años se ha producido un avance sustancial en esta dirección y muchos grupos de investigación han abordado esta cuestión. Un enfoque distinto es aumentar el número de moléculas individuales activas por cuadro sin cambiar la intensidad y otros parámetros experimentales21,29. Sin embargo, esta técnica tiene un coste en el que una gran activación podría dar lugar a la superposición de firmas de moléculas individuales limitadas por la difracción, lo que daría lugar a moléculas individuales indistinguibles y, posteriormente, aumentaría la complejidad30. Un trabajo reciente de Lin et al. compararon cuantitativamente la calidad de imagen de microtúbulos inmunomarcados utilizando Alexa Fluor 647-dye19. Otro estudio de Diekmann et al. demostró que dos factores críticos (es decir, precisión de localización y eficiencia de etiquetado) determinan la calidad de la imagen SMLM. Investigaron sistemáticamente las consecuencias de la velocidad en la calidad de la imagen para diferentes tintes (AF647, CF680, CF660C, Dy634) con diferentes eficiencias e intensidades de etiquetado21. Hasta donde sabemos, las proteínas fotoconmutables como Dendra 2 nunca han sido demostradas para la microscopía de localización de imágenes rápidas y de lapso de tiempo y, por lo tanto, representan una clase importante de sondas utilizadas en microscopía de superresolución. Específicamente, las proteínas fotoconmutables permiten la clonación/conjugación con proteínas de interés, lo que las hace adecuadas para estudiar procesos biológicos (como la progresión de enfermedades31,32,33) y ayuda a comprender el mecanismo subyacente.

Una técnica reciente basada en aprendizaje profundo sugiere acelerar el tiempo post-adquisición sin comprometer la resolución espacial en 2D, o la localización 3D de cada molécula parpadeante por fotograma34,35. Otra técnica que promete mejorar la resolución temporal es un dispositivo de adquisición basado en tecnología sCMOS que supera a la tecnología EMCCD al reducir el tiempo de lectura sin comprometer la eficiencia cuántica21,27. Una imagen reciente de dSTORM de células fijas utilizando una cámara sCMOS con tinte Alexa 647 como sonda ha mostrado potencial para SMLM36 rápido. Además, las imágenes STORM también se realizan a velocidades bajas a altas para lograr una resolución y calidad de imagen óptimas21,37.

En general, investigar procesos biológicos complejos requiere una rápida adquisición de datos. Esto tiene muchos beneficios, incluida la observación de dinámicas de milisegundos/submilisegundos y la reducción sustancial de los largos tiempos de adquisición. Estos factores tienen consecuencias sobre la relación señal-ruido, el fondo de la imagen y la deriva del sistema. Aquí, presentamos un método simple, implementado mediante la reducción del tiempo de adquisición de datos en arquitecturas convencionales de detección de una sola molécula, para superar los cuellos de botella que afectan a muchos procesos biofísicos que ocurren en escalas de tiempo más rápidas. Específicamente, estudiamos los grupos de HA y los cambios dinámicos relacionados a lo largo del tiempo en un entorno celular. Para lograr esto, se propone un método de adquisición de exposición corta (\(\sim 5~{\text {ms}}\)) (impulsado por un detector sCMOS). El objetivo es comprender y evaluar el impacto del corto tiempo de exposición en la precisión de la localización y su consecuencia en el análisis de agrupamiento. En general, el método mejora la resolución temporal a costa de la precisión de la localización y al mismo tiempo preserva los parámetros biofísicos relacionados con la formación de grupos (por ejemplo, densidad de grupos, \(\#\) moléculas/grupo, dispersión de grupos, etc.).

Sistema de hardware clave involucrado en el proceso de adquisición de datos SMLM. El tiempo que tarda una adquisición de un solo cuadro es la suma del tiempo que tarda cada subsistema en el proceso de adquisición de datos. Aquí, “Lectura/escritura” se abrevia como r/w.

Imagen súper resuelta de moléculas de HA 24 h después de células NIH3T3 transfectadas con D2HA transitorias durante 5 ms, 30 ms y 50 ms, datos adquiridos expuestos utilizando Zyla 4.2 plus (Andor). La agrupación \(2\times 2\) se utiliza al adquirir datos. Cada imagen reconstruida contiene aproximadamente 20.000 moléculas de HA. También se muestran las imágenes de transmisión y fluorescencia correspondientes (a 510 nm).

Los gráficos de precisión de localización de las imágenes reconstruidas obtenidas tanto para avance (\(5~{\text {ms}} - 30~{\text {ms}} - 50~{\text {ms}}\)) como para reverso ( \(50~{\text {ms}} - 30~{\text {ms}} - 5~{\text {ms}}\)) esquemas. También se muestran los diagramas de barras correspondientes para la precisión de localización para casos directos e inversos junto con el cambio de resolución de partículas (PAR-Shift).

(A–C) Imágenes superresueltas particionadas (usando el método K-medoid) de moléculas de HA distribuidas en la celda para grabaciones en \(5~{\text {ms}}\), \(30~{\text {ms }}\) y \(50~{\text {ms}}\). (D–F) También se estiman los parámetros correspondientes, como \(\#~moléculas\), el área y la densidad por partición. (G, H) Los centroides y la dispersión de las particiones junto con el cambio por pares (\(50 \& 5\), \(30 \& 5\) y \(30 \& 50\)) de estos parámetros también son se muestra mediante diagramas de barras.

(A – C) DBSCAN estimó grupos moleculares para datos obtenidos con un tiempo de exposición corto junto con SMLM estándar y un tiempo de exposición largo (\(50~{\text {ms}}\)). (D) Una superposición de las localizaciones agrupadas, codificadas por colores según el tiempo de integración. (E) Los gráficos muestran el valor promedio de los parámetros biofísicos estimados (número de moléculas de HA por μm2, número de moléculas por grupo (\(\# N / C\)), área del grupo (μm2) y fracción agrupada \(\sum _i C_i / C_A\) ) relevante para los grupos moleculares formados, donde \(C_i\) y \(C_A\) corresponden al área total del grupo y al área de la célula, respectivamente.

Gráficos de precisión de tiempo por fotograma y localización. Es evidente que una ganancia en la resolución temporal da como resultado una resolución espacial deficiente y viceversa (ver curva negra). La curva roja (tiempo de integración real) corresponde al aumento del tiempo por fotograma con el tiempo de exposición según el esquema de la Fig. 1.

Imágenes de células vivas de células transfectadas con Dendra2-HA. Las moléculas no agrupadas se eliminan de las imágenes para su posterior análisis. Además de la precisión de la localización, también se muestra. Los datos se dividen en 5 partes (A – E) según el tiempo de adquisición (0 a 8 min, 9 a 16 min, 17 a 24 min, 25 a 32 min, 33 a 40 min). Además, también se muestra la superposición de toda la imagen (por puntos de tiempo). (F) También se muestra la precisión de la localización frente al tiempo junto con la imagen de fluorescencia de la célula transfectada.

La técnica propuesta se emplea para mejorar la resolución temporal del SMLM estándar reduciendo el tiempo de exposición del dispositivo de detección (cámara sCMOS). Esto se basa en la suposición de que una fracción sustancial de moléculas parpadea durante menos que el período de parpadeo promedio (\(30~{\text {ms}}\))38,39,40. Nuestro enfoque es capturar estas moléculas de parpadeo rápido con una vida útil inferior a \(\le 5~{\text {ms}}\)1. En la presente técnica, la cámara sCMOS funciona con tiempos de exposición cortos para velocidades de cuadro rápidas. Esto ayuda a capturar moléculas que parpadean rápidamente. En la Fig. 1 se muestra un diagrama esquemático que brinda detalles de adquisición para el sistema \(SMLM corto\) y su comparación con el SMLM estándar.

La Figura 2 muestra las imágenes superresueltas reconstruidas de la célula NIH3T3 transfectada con Dendra2-HA (ver imagen de transmisión). El protocolo de transfección y las condiciones del cultivo celular se detallan en la sección de métodos. Para caracterizar el impacto del tiempo de exposición del detector en las firmas de moléculas individuales, recopilamos imágenes en orden creciente, \(5~{\text {ms}},~30~{\text {ms}}, 50~{\text {ms }}\) como se muestra en la Fig. 2. Se detecta un total de 20.000 moléculas de aproximadamente 5.000 fotogramas. Los gráficos de localización correspondientes se muestran en la Fig. 3. Los gráficos indican una reducción en la precisión de la localización con una disminución en el tiempo de exposición, lo que se debe a una menor cantidad de fotones detectados por molécula. Específicamente, observamos un cambio PAR de \(11,86~{\text {nm}}\) en comparación con el SMLM estándar. Cuando se repite el mismo experimento en orden decreciente, la tendencia continúa, aunque la localización promedio ha cambiado un poco y se observa un cambio PAR de \(10.19~{\text {nm}}\). Esto sugiere que un sacrificio en la precisión de la localización conduce a una mejora en la resolución temporal. El tiempo de exposición tiene consecuencias sobre la precisión de la localización. Esto sugiere un cambio de PAR hacia el límite de difracción en comparación con el SMLM estándar y más allá (en \(50~{\text {ms}}\)). En general, se observa un cambio PAR promedio (en términos de precisión de localización) de \(11,86~{\text {ms}}\) a lo largo de todos los experimentos.

Para acceder a la resolución de las imágenes reconstruidas hemos realizado análisis de Correlación de Anillos de Fourier (FRC)41,42. Se prefiere FRC a otras métricas ya que no requiere ninguna información previa y la métrica se puede calcular en tiempo real. FRC se basa en el hecho de que cada sistema tiene una frecuencia de corte efectiva y la resolución está determinada por las altas frecuencias espaciales admitidas por el sistema. La figura S4-1 muestra el análisis de FRC para 5 ms, 30 ms y 50 ms para los cuales los valores FIRE correspondientes son 60,36 nm, 93,99 nm y 98,43 nm, respectivamente. Se elige un umbral estándar de \(1/7=0,143\). La frecuencia espacial donde el FRC cae por debajo del umbral se define como frecuencia de corte y se calcula la resolución. Un análisis detallado de ambos casos se puede encontrar en el Suplemento 4.

Para acceder al impacto del corto tiempo de exposición en los grupos de moléculas individuales, empleamos nuestra técnica para visualizar particiones en células NIH3T3 transfectadas con Dendra2-HA y las condiciones experimentales utilizadas principalmente para SMLM. Los resultados se muestran en la Fig. 4 para el esquema de avance, es decir, comenzando desde una exposición corta (\(5~{\text {ms}}\)) hasta una larga exposición (\(50~{\text {ms}}\)) . La adquisición de datos completa para los esquemas de medición directa e inversa se detalla en el Suplemento 1. Los esquemas se emplean para garantizar un registro sin sesgos y uniformidad entre los conjuntos de datos en diferentes tiempos de exposición. Para garantizar la similitud, hemos utilizado la segmentación no supervisada basada en K-mediod43 y se estiman los parámetros relacionados (centroide, extensión y tamaño (área) de la partición). A partir de los mapas de moléculas individuales (con particiones etiquetadas con diferentes colores y sus centroides), se puede determinar visualmente la consistencia (ver Fig. 4A-C). Además, también se estiman los parámetros correspondientes relacionados con el número de moléculas, el área y la densidad de las particiones (ver Fig. 4D-F). Estos parámetros sugieren una adquisición de datos libre de sesgos con diferentes tiempos de exposición tanto para casos directos como inversos, aunque los experimentos se realizan en diferentes momentos. La Figura 4G muestra la ubicación de los centroides de las particiones. Para la mayoría de estas particiones, el cambio en la ubicación del centroide es inferior a 18 nm y el cambio en la dispersión media es \(58~{\text {nm}}\) (ver Fig. 4H). Esto aún proporciona un valor excelente considerando el hecho de que las moléculas se detectan y localizan de forma independiente para la recopilación secuencial de datos en diferentes tiempos de exposición (\(5~{\text {ms}}, ~30~{\text {ms}}, ~50 ~{\text {ms}}\)). Además, cambios relativamente pequeños en el centroide \(\Delta C\) y la extensión \(\Delta S\) (por pares, entre 5 y 50 ms; 5 y 30 ms; 30 y 50 ms) indican similitud de particiones (ver Fig. .4G,H). En general, la Fig. 4 sugiere una recopilación de datos libre de sesgos para experimentos realizados en diferentes momentos y en diferentes tiempos de exposición.

El siguiente paso inmediato es comprender el proceso de agrupación en células NIH3T3 transfectadas para comprender la dinámica de HA en el modelo Influenza-A. Empleamos la técnica de agrupamiento DBSCAN para los datos de una sola molécula registrados en \(5~{\text {ms}}\) y los comparamos con el SMLM estándar (\(30~{\text {ms}}\)). DBSCAN tiene la capacidad distintiva de tener en cuenta sólo los datos agrupados y pasar por alto los datos no agrupados. Aquí hemos elegido un límite para la distancia HA-HA de \(80~{\text {nm}}\) y un mínimo de 35 moléculas de HA para reconocer grupos. Los grupos de HA correspondientes se muestran en las figuras 5A–C. Aunque el estudio propuesto se centra en la adquisición de datos de exposición corta (\(5~{\text {ms}}\)), también hemos adquirido datos con una exposición relativamente más larga (\ (\sim 50~{\text {ms}}\)) para mantener la coherencia. Para garantizar que se observen los mismos grupos para todos los tiempos de exposición, en la Fig. 5D se muestra una superposición de las localizaciones agrupadas, donde el tiempo de integración está codificado por colores. Además, parámetros biofísicos como la densidad de los grupos (1138 mol./μm2), el área del grupo (0,105 μm2), el número de moléculas por grupo (105) y la fracción agrupada o la relación relativa de llenado del grupo (\(6,33 \%\) por celda) también se determinan. Los valores de los parámetros son consistentes con el estudio reportado en la literatura32. No vimos cambios sustanciales en estos parámetros para tiempos de exposición cortos, especialmente en comparación con el SMLM estándar. Esto es evidente en los gráficos que se muestran en la Fig. 5E. Visualmente, el grupo parece consistente en todo el tiempo de exposición. Esto confirma el hecho de que la información estructural relacionada con los grupos de HA se conserva en tiempos de exposición cortos.

Para comprender las repercusiones de un tiempo de exposición corto en la calidad de la imagen, calculamos la precisión de localización media. Es bastante evidente que la precisión de la localización se ve afectada con un tiempo de exposición corto. Específicamente, una disminución en el tiempo de exposición en comparación con el SMLM estándar da como resultado una ligera disminución en la precisión de localización (o resolución espacial) de aproximadamente \(11,86~{\text {nm}}\) (correspondiente a un cambio de PAR hacia la clásica límite de difracción, \(\sim \lambda / 2\)). Por lo tanto, el costo de las imágenes rápidas de superresolución es un sacrificio parcial de la resolución espacial (Fig. 6). Sin embargo, esto no alteró significativamente nuestro análisis sobre la agrupación de moléculas individuales para el modelo de enfermedad propuesto (modelo Influenza-A). En los suplementos 1 y 2 se analiza un estudio detallado de otra muestra. Esto indica que una pérdida en la precisión de la localización puede ser aceptable para analizar grupos de moléculas individuales y su dinámica con el fin de obtener una ganancia en la resolución temporal. Esto también sugiere que existe algún tipo de relación de incertidumbre entre la precisión de la localización y la resolución temporal en lo que respecta a las imágenes de una sola molécula.

Para fundamentar la ventaja de \(SMLM corto\) para una alta resolución temporal, se llevan a cabo experimentos en células NIH3T3 vivas. Después de la transfección con el plásmido Dendra2-HA, se tomaron imágenes de las células durante un período prolongado (aproximadamente 40 minutos) y los datos se dividen en 5 conjuntos, cada uno de 8 minutos de duración. Aproximadamente, se recopilan 5000 imágenes para cada conjunto y se identifican 3000 moléculas individuales. Posteriormente, se reconstruyen imágenes súper resueltas para cada conjunto y se traza la precisión de la localización como se muestra en la Fig. 7. El análisis de conglomerados se lleva a cabo utilizando el algoritmo DBSCAN y se eliminan las moléculas no agrupadas. El análisis visual y la superposición de todas las imágenes (por puntos de tiempo) evidencian cambios temporales en los grupos de HA que se forman después de la transfección, como lo indican las flechas azules en la Fig. 7. Esto sugiere, por primera vez, la naturaleza dinámica del proceso de agrupación donde HA -Los grupos se forman y/o migran durante las primeras etapas de la infección viral en un sistema celular (modelo Influenza-A). El gráfico de precisión de localización versus tiempo (ver Fig. 7F) no muestra cambios significativos en la precisión de localización promedio, lo que indica el potencial de \(SMLM corto\) para obtener imágenes prolongadas de superresolución y estudiar eventos que ocurren rápidamente (aquí, dinámica colectiva). de moléculas de HA) en una célula viva.

Demostramos la técnica \(short-SMLM\) para acelerar imágenes de superresolución basadas en una sola molécula. Con el avance de la tecnología de cámaras sCMOS, es posible recopilar datos en tiempos de exposición más cortos; por supuesto, esto no puede ser inferior al límite de resolución temporal en microscopía de fluorescencia18. Dado que el parpadeo de una sola molécula se produce en escalas de tiempo variables que van desde unos pocos hasta decenas de milisegundos, el proceso de adquisición de datos se puede acelerar mediante la recopilación de imágenes en unos pocos milisegundos en comparación con el SMLM1 estándar. Esto requiere la detección de moléculas que parpadean rápidamente. La técnica es beneficiosa para visualizar procesos biofísicos (agrupación, migración, unión y difusión a nivel de una sola molécula). En general, la adquisición de datos con tiempos de exposición prolongados (utilizados en SMLM estándar) elimina eventos (parpadeo y fluctuaciones) que ocurren en tiempos de exposición relativamente cortos. Además, la exposición relativamente larga que se utiliza con frecuencia en SMLM puede tergiversar significativamente las ubicaciones de grupos de moléculas individuales que cambian dinámicamente. En el Suplemento 3 se incorpora un estudio detallado relacionado con las características de parpadeo de Dendra2 con el tiempo de exposición.

Aquí, informamos la grabación en tiempos cortos de adquisición de datos, que es 2,76 veces menor que el SMLM estándar. Los resultados muestran que hay un cambio en la precisión de la localización (resolución) hacia el límite de difracción clásico. Específicamente, se observa un cambio PAR (en términos de precisión de localización) de \(11,86~{\text {nm}}\) en comparación con SMLM. Sin embargo, el cambio es tolerable cuando se accede a los beneficios de la alta resolución temporal. Un análisis más detallado de la distribución de una sola molécula ha revelado un alto grado de coherencia en la recopilación de datos en un tiempo de exposición corto. Esto se determina además mediante los parámetros estimados, como el número de moléculas, el área y la densidad de los grupos de moléculas individuales. El hecho de que el centroide y la dispersión de la distribución sean insignificantes habla mucho de la coherencia y confiabilidad de la recopilación de datos en tiempos de exposición cortos.

Para comprender la formación de grupos en una célula viva transfectada con ADN plasmídico Dendra2-HA (modelo de enfermedad de influenza A), se emplea la técnica de agrupamiento DBSCAN. Los resultados muestran coherencia en la formación de grupos para los datos recopilados con un tiempo de exposición de 5 ms hasta 50 ms. Además, DBSCAN ha permitido la determinación de parámetros biofísicos críticos, como la densidad de grupos, el área de grupos, el número de moléculas por grupo y la fracción agrupada en una célula. La imagen de lapso de tiempo se realiza en una célula transfectada viva para visualizar la dinámica temporal de los grupos de HA (ver Fig. 7). Los resultados indican la formación y migración de grupos de HA con el tiempo. Estos parámetros están directamente asociados con la tasa de infectividad y la progresión de la enfermedad en un modelo de enfermedad (en este caso, Influenza-A)32,44. Entonces, \(SMLM corto\) facilita el estudio de la dinámica temporal de las partículas virales (en este caso, moléculas individuales de HA), lo que es un paso más hacia el diagnóstico y la terapia tempranos. A un nivel molecular único, esto significa utilizar fármacos potenciales para alterar los grupos de HA durante la infección por gripe A. Además, observamos una relación entre la resolución temporal y la precisión de la localización, es decir, un aumento en la resolución temporal (tiempo de exposición corto) resultó en una disminución proporcional en la precisión de la localización y viceversa. Teniendo en cuenta el beneficio de la resolución temporal, el cambio PAR (hacia el límite de difracción) puede ser aceptable para obtener información sobre los eventos que ocurren rápidamente en un sistema celular.

En la Fig. 1 se muestra una caricatura básica de los procesos de adquisición de datos involucrados en un sistema de microscopía SMLM típico. También se representa el tiempo involucrado para procesos específicos, es decir, el tiempo de exposición \(t_{exp}\), el tiempo de lectura \(t_r\) y ​​el tiempo de lectura y escritura de la PC (\(t_{r/w}\)). Específicamente, la tasa de transferencia de cuadros (FR) para la tecnología sCMOS se puede expresar como,

donde, el tiempo de lectura viene dado por \(t_{r/w}=\frac{1}{ N + Dr}\), con N como el número de píxeles (\(\#\) píxeles) y \( D_{r}\) es la velocidad del digitalizador. Tenga en cuenta que la velocidad de fotogramas se puede aumentar reduciendo el tiempo de exposición y/o el tamaño de fotograma. En la práctica, esto se traduce en identificar moléculas de parpadeo rápido (moléculas con vidas cortas) que tienen el potencial de acelerar la reconstrucción de imágenes súper resueltas.

Un SMLM típico se personaliza según lo requiera la adquisición de datos de baja exposición. Dos láseres, un láser de activación de 405 nm (Oxxius, Francia) y un láser de lectura de 561 nm (Oxxius, Francia), se combinan con un espejo dicroico. Una lente optotune (EL-10-30-CI-VIS-LD-MV, óptica Edmund) enfoca haces combinados colineales en la apertura posterior de una lente objetivo de inmersión en aceite 1.3NA 100\(\times\)(Olympus) de El microscopio invertido IX81 Olympus. Al cambiar la distancia focal de la lente optotune, se puede variar el campo de visión45. Un filtro dicroico acoplado a un cubo filtrante distingue la señal de fluorescencia emitida del haz de iluminación. La señal de fluorescencia es recogida por el mismo objetivo y enfocada por la lente del tubo del microscopio. Se introduce un factor de aumento adicional de 2,67X mediante una combinación de dos lentes de tubo \(f_{1}\) = 75 mm y \(f_{2}\) = 200 mm antes de enfocar en la cámara sCMOS (Zyla 4.2 plus, tamaño de píxel 6,5 µm, Andor). El sistema de imágenes tiene un aumento total de 267. Se utiliza un conjunto de filtros Notch (405 nm y 561 nm Shemrock, EE. UU.) para cortar señales no deseadas. La intensidad de los haces de activación e iluminación se puede controlar con precisión mediante una combinación de placas polarizadoras y de cuarto de onda, que se instalan en la trayectoria de cada rayo láser11,12,46. Además, se integra un brazo óptico separado con el sistema (con una fuente de luz azul (470–490 nm)) para visualizar las células trenfectadas. El sistema puede cambiar entre el modo de fluorescencia y el de superresolución según sea necesario sin alterar la etapa de la muestra.

Para el experimento se utilizaron células de fibroblastos NIH-3T3 obtenidas de nuestro colaborador, el profesor Upendra Nongthomba (Ciencias Biológicas, Instituto Indio de Ciencias, Bangalore, India). Elegimos trabajar con el modelo Influenza-A, donde las células de fibroblastos NIH-3T3 se transfectaron transitoriamente con el plásmido Dendra2-HA. Para empezar, las células se descongelaron de la muestra conservada en nitrógeno líquido (\(-196 \circ C\)) y se cultivaron en medios de crecimiento (90\(\%\)DMEM + 9\(\%\) suero bovino de ternera. + 1\(\%\) penicilina-estreptomicina). Después de 24 h después del cultivo, se añadió una nueva mediana de crecimiento después de desechar la solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X lavada. La siembra se realiza una vez que la confluencia de células es mayor que 80\(\%\)densidad con un recuento de células de aproximadamente \(10^{5}/{\text {cm}}^{2}\). Después de la siembra en dos pases, las células transfectadas se cultivan en un disco de 35 mm (con cubreobjetos). Se mantienen 80–90\(\%\) confluentes cultivados para la transfección. Seguimos el protocolo de transfección transitoria de Lipofectamine 3000 (Life Technologies, Invitrogen) para la transacción Dendra2HA en células NIH3T3. Para obtener imágenes en vivo, las células se lavaron con 1X PBS y se agrega medio de crecimiento después de 24 h de transfección. Sin embargo, para obtener imágenes de células fijadas, las células se lavaron con PBS 1X, se fijaron con formaldehído al 3\(\%\) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, luego de desechar los líquidos, se utiliza una gota de medio de montaje fluorsave (Thermofisher Scientific) y en la parte superior se coloca un cubreobjetos rectangular No.0(BlueStar). Luego, las celdas fijadas se sellaron al aire con pintura para uñas para su conservación e investigación durante mucho tiempo.

Estudiamos las proteínas Dendra2 conjugadas con la proteína viral de la influenza hemaglutinina (Dendra2HA) como una proteína fotoactivable para sondear la dinámica de la HA en una célula transfectada. Tras la irradiación con luz ultravioleta (360–420 nm), la proteína cambia al estado fluorescente rojo. Dendra2HA no activado se puede visualizar en máximos de excitación-emisión a 480/507 nm, mientras que la proteína Dendra2HA activada posee máximos de excitación/emisión a 553/573 nm. La proteína fluorescente Dendra2HA es clave para comprender la propagación del virus de la influenza en células de mamíferos (como las células NIH3T3). Esto se ha asociado con las controvertidas balsas de lípidos ricos en colesterol. El virus de la influenza se ensambla a partir de dominios de balsa en la membrana plasmática. La expresión de HA47, el tamaño, el número y la densidad del grupo son parámetros cuantitativos para comprender la infección y la liberación de yemas de las células infectadas48. Los sistemas existentes31,49 han mostrado la presencia de grupos de moléculas de HA únicamente con un tiempo de exposición elevado. Tras la fotoactivación seguida de una excitación a 561 nm, con el tiempo de exposición deseado, la fluorescencia de moléculas individuales se registra utilizando sCMOS. La precisión de la localización se calculó utilizando la relación de Thompson50. Durante la experimentación, se encontró que el ruido de fondo promedio es \(\sim 27\) fotones/píxel, y el número promedio de fotones es \(\sim 170\). Las imágenes se graban en \(512\times 512\) píxeles y el tamaño de píxel de la imagen se calcula en 82,15 nm (para un aumento del sistema de 267X). Además, sCMOS viene con el beneficio de una tasa de transferencia de datos reducida (\(\sim 10 ~{\text {ms}}\)) en comparación con EMCCD que tiene una tasa fija de \(\sim 30~{\text {ms}}\) para una ventana de detección de \(512 \times 512\) píxeles. Realizamos la adquisición con un tiempo de exposición de 5 ms, 30 ms y 50 ms con un intervalo de tiempo de 1 min entre los experimentos y el registro de datos consiguientes. Cabe señalar que una exposición de 5 ms se traduce esencialmente en la adquisición de un solo cuadro efectivo (de tamaño, \(1024 \times 1024\) píxeles) de \(15~{\text {ms}}\) (una exposición tiempo de \(5~{\text {ms}}\) y un tiempo de lectura de \(10~{\text {ms}}\) ) . Experimentalmente, la velocidad de adquisición de datos (considerando solo el tiempo de exposición, el tiempo de lectura y sin tener en cuenta la velocidad de escritura/lectura de datos del sistema) de 5 ms, 30 ms, 50 ms de conjuntos de datos expuestos son 66 fps, 25 fps y 15 fps, respectivamente. Adquirimos un conjunto de datos directos, que es un bucle de 5 ms-30 ms-50 ms-30 ms-5 ms de exposición adquirida, y el conjunto de datos inverso es un bucle de 50 ms-30 ms-5 ms-30 ms. -Conjunto de datos adquiridos de exposición de -50 ms en diferentes celdas con la misma configuración de cámara (consulte el Suplemento 4). En general, adquirimos un total de 5 conjuntos de datos para el estudio. Se utiliza una agrupación de píxeles de 2 \(\times\) 2 durante todo el proceso de adquisición de datos. Las técnicas de agrupación de píxeles combinan varios píxeles en un solo píxel, lo que genera un área expuesta más grande y, por lo tanto, la recolección de más fotones con una reducción del ruido de lectura, aunque el tiempo de exposición sea bajo. La adquisición de datos se realiza a través de la plataforma Andor Solis, que escribe los datos directamente en el SSD instalado en el sistema de la PC. Todo el conjunto de datos adquirido se guarda como una pila en formato .tif de 16 bits. La potencia del láser utilizada: 561 nm es 49 mW y 405 nm 5 μW. En el caso de la adquisición de datos de exposición de 5 ms, la potencia de los láseres de 405 nm y 561 nm se mantuvo en 6 μW y \(20~{\text {mW}}\), respectivamente (ver Suplemento 5).

Las moléculas individuales se cuentan a partir de los datos registrados después de un posprocesamiento estándar que incluye la resta de fondo de los datos sin procesar y el establecimiento de umbrales32,51,52,53. Específicamente, el fondo se estima dinámicamente a partir de los propios datos sin procesar y hemos elegido un umbral que es 5 veces el fondo. El método de conteo considera los escasos estallidos fluorescentes dentro del período de parpadeo característico como un conteo molecular con conteos repetidos de moléculas condensados ​​en uno solo32,53.

Cada fotograma .tif de 16 bits se convierte inicialmente en un recuento de fotones utilizando la proporción de fotones a píxeles. La relación entre fotones y píxeles es la medida de la pendiente de la varianza frente a la intensidad media50. La reconstrucción de una sola molécula se realiza utilizando el código einzel en matlab2021b1,10,11. La reconstrucción sigue los pasos estándar. El primer paso del proceso es la resta de fondo utilizando el algoritmo de bola rodante54. La resta de fondo es importante porque no contribuye a determinar la posición del emisor, sino que se suma a la señal, disminuyendo así la SNR. Después de la resta del fondo, la identificación de la molécula probable se realiza mediante un umbral de intensidad. Este proceso consiste en buscar una molécula probable que sea mayor que el umbral (T1) a través del marco dado. Se tabula todo el valor de píxel por encima de T1. Una ventana de entre 3 \(\times\) 3 píxeles y 7 \(\times\) 7 píxeles que tienen alta intensidad como origen con al menos tres píxeles que tienen un valor de intensidad mayor que el umbral mínimo se pasa después del umbral para determinar las coordenadas. e intensidad en su interior. Para cada detección de objeto, el cálculo del centroide respectivo proporciona las coordenadas iniciales estimadas para el ajuste gaussiano,

donde, la amplitud del ajuste gaussiano proporciona el número de fotones detectados en esa molécula. Todas las moléculas son del mismo tamaño y la intensidad la decide el número de fotones.

Los datos brutos utilizados en el estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

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Jigmi Basumatary, Neptune Baro y Partha Pratim Mondal

Departamento de Física, Universidad de Pisa, Pisa, Italia

Chica Cella Zanacchi

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Todos los autores contribuyeron de igual forma en este trabajo.

Correspondencia a Fancesca Cella Zanacchi o Partha Pratim Mondal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Basumatary, J., Baro, N., Zanacchi, FC et al. El SMLM resuelto temporalmente (con un gran cambio de PAR) permitió la visualización de la formación y migración dinámica de grupos de HA en una célula viva. Informe científico 13, 12561 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39096-4

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Recibido: 19 de enero de 2023

Aceptado: 20 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39096-4

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