Aplicación del nanoconjugado de níquel-quitosano como agente antifúngico para combatir la pudrición del trigo por Fusarium

Jun 11, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 14518 (2022) Citar este artículo

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Los agroinvestigadores intentan incesantemente encontrar una biomolécula potencial con propiedades antifúngicas para sustituir la aplicación de fungicidas sintéticos en los campos agrícolas. La pudrición causada a menudo por Fusarium solani provocaba graves pérdidas en las cosechas de trigo cada año. El quitosano y sus nanoderivados metálicos tienen una propiedad antifúngica de amplio espectro. Nuestro estudio interdisciplinario aborda la aplicación del nanoconjugado de níquel y quitosano (NiCNC) contra la pudrición por Fusarium del trigo, en comparación con las nanopartículas de quitosano (CNP) y el fungicida comercial Mancozeb. Los CNP y NiCNC se caracterizaron mediante espectrofotometría UV-Vis, HR-TEM, FESEM, EDXS y FT-IR. Tanto los CNP como el NiCNC resultaron eficaces contra el crecimiento de hongos, de los cuales el NiCNC a 0,04 mg/ml mostró la terminación completa de F. solani cultivada en un medio adecuado. El análisis ultraestructural de los conidios de F. solani tratados con NiCNC reveló daños pronunciados y alteración de la superficie de la membrana. El estudio microscópico de fluorescencia reveló la generación de estrés oxidativo en el sistema fúngico tras la exposición al NiCNC. Además, NiCNC mostró una reducción en la incidencia de la pudrición en un 83,33% de las plántulas de trigo, lo que se confirmó mediante la observación de secciones anatómicas del tallo. La aplicación de NiCNC ayuda a la plántula a superar el efecto adverso del patógeno, el cual fue evaluado a través de atributos de índices de estrés.

Durante años, ha sido un gran desafío para los agrocientíficos controlar las enfermedades fúngicas que destruyen una gran escala de cultivos alimentarios económicamente importantes. Los hongos patógenos causaron graves pérdidas a la producción agrícola mundial1,2,3,4. Uno de esos patógenos perjudiciales es Fusarium spp. que causa infección en una amplia gama de especies de plantas. Principalmente causa enfermedades como marchitez, tizón de la cabeza, pudrición del pie y de la raíz5,6. La pudrición del pie y de la raíz del trigo (Triticum aestivum L.), que ocurre cerca de la base del tallo de la raíz, es una de las enfermedades fúngicas más comunes que causan enormes pérdidas de cosechas en las principales zonas productoras de trigo de Europa, Asia, América del Norte y Australia7,8. 9,10. Varias especies de Fusarium son consideradas hongos fitopatógenos contra cereales de grano pequeño como trigo, cebada, avena, etc.11. Según los informes publicados en 202012, hay casi nueve especies diferentes de Fusarium que causan la pudrición del trigo. La especie Fusarium solani es uno de los hongos causantes de pudrición más frecuentes en cultivos de importancia económica como el trigo13,14. Se informa que la pudrición del pie y de la raíz del trigo es causada predominantemente por Fusarium solani y Fusarium oxysporum15,16. Las epidemias de pudrición por Fusarium provocan graves pérdidas de cosechas cada año debido a una reducción significativa en la producción de granos y a los obstáculos a la calidad17. La pudrición ataca la porción basal de la planta y bloquea el flujo de agua y nutrientes al follaje. Tras la infección, varias especies de Fusarium producen metabolitos secundarios que amenazan la salud llamados micotoxinas, que se acumulan en las plantas y su ingesta puede ser letal para el sistema humano18. La especie Fusarium solani es la mayor productora de toxina T-2 (T = Trichoteceno), que es un precursor del neosolaniol, un compuesto neurotóxico19. Por lo tanto, el manejo de la pudrición por Fusarium solani en los principales cultivos económicamente importantes es crucial para minimizar la pérdida de rendimiento.

En los últimos años, los científicos han diseñado biomoléculas versátiles, como nanopartículas (NP) o nanoconjugados (NC), y las han utilizado para controlar las infecciones fúngicas20. Varios investigadores han utilizado el quitosano para la síntesis de NP o NC debido a su biocompatibilidad, mayor permeabilidad a la membrana biológica, rentabilidad, baja toxicidad y carácter ecológico21,22. Los científicos ya han llegado a la conclusión de que el quitosano es un agente antifúngico debido a su naturaleza policatiónica que puede unirse a varios componentes celulares cargados negativamente de hongos patógenos23,24,25. La conversión de quitosano en nanopartículas de quitosano (CNP) da como resultado un aumento de su actividad como componente fungicida debido a su mayor área superficial y mayor eficiencia de encapsulación26. Además de los CNP, los científicos han intentado la síntesis de conjugados metálicos de nanoquitosano mediante técnicas versátiles, como el método de gelificación ionotrópica, reticulación de emulsiones, etc.27,28. Pero hay muy pocos informes sobre el uso de nanoquitosano metálico como agente antifúngico prometedor. En comparación con el quitosano y las CNP, las NP metálicas conjugadas con quitosano exhiben más actividades biológicas debido a sus propiedades estructurales y funcionales alteradas, como mayor tamaño y área de superficie, presencia de más grupos catiónicos, grupos funcionales activos y mayor capacidad de condensación28.

El control de la infección por Fusarium en los principales cultivos de importancia económica es una tarea muy desafiante para los agroinvestigadores. Los agricultores practican estrategias de control como la rotación de cultivos, el uso de productos botánicos, el control biológico y el manejo de rastrojos, pero la tasa de éxito en el control de la pudrición no fue satisfactoria29,30,31,32. Se ha informado que los fungicidas químicos sintéticos como Mancozeb, mediante tratamiento de semillas o pulverización, controlan esta enfermedad en mayor medida33. Pocos informes de autores anteriores sugieren el uso de Mancozeb para impartir entre un 50 y un 100 por ciento de inhibición del crecimiento micelial de F. solani, responsable de causar la pudrición del pie y de la raíz34,35. Pero su uso excesivo es ambientalmente desfavorable debido a su alto efecto tóxico para el suelo y el sistema de cultivo36. En este contexto, es más preferible considerar una molécula biodegradable y respetuosa con el medio ambiente como el quitosano y sus conjugados. Varios investigadores han informado previamente sobre la actividad antipatogénica de nanopartículas metálicas como Ag, Cu, Zn, Fe, Ni, etc.37. La exposición de nanopartículas metálicas a los microbios genera estrés oxidativo que induce daño a las células respiratorias y aumenta la fuga de proteínas al desintegrar la permeabilidad de la membrana. Un grupo de trabajadores demostró el efecto antifúngico del nanoquitosano de plata contra el complejo de especies de Fusarium38. Pero la aplicación de un metal caro como la plata a las prácticas agrícolas en los países en desarrollo es agotadora tanto para los agricultores como para el gobierno.

El metal níquel es un micronutriente esencial requerido especialmente para el crecimiento y elevación del contenido de clorofila en plántulas de trigo (1 mg kg-1 de peso fresco)39. Su deficiencia en las plantas puede afectar negativamente el metabolismo del nitrógeno, la absorción de Fe, el crecimiento de las plantas y la senescencia. Pero un nivel más alto de exposición al Ni2+ genera toxicidad para las plantas y se acumula en el suelo, dando lugar a diversos riesgos para la salud40. También hay informes de que el ion Ni2+ muestra citotoxicidad contra una gran cantidad de fitopatógenos al inducir la capacidad de resistencia a enfermedades en el sistema vegetal37. El níquel actúa como constituyente de varias metaloenzimas, como la ureasa, la superóxido dismutasa, la metil coenzima M reductasa, la acetil coenzima A sintasa, etc., como resultado, su deficiencia reduce la actividad enzimática y afecta la asimilación de nitrógeno41. Es un metal redox inactivo que no genera especies reactivas de oxígeno (ROS) directamente. Pero un alto nivel de exposición puede provocar peroxidación lipídica y fuga de electrolitos en las plantas42. Por lo tanto, el níquel es un micronutriente vital esencialmente necesario para el crecimiento de las plantas y el correcto funcionamiento de su metabolismo. La implementación de este metal vital en una concentración mínima para la síntesis de nanopartículas dará como resultado una mayor bioactividad de la molécula sintetizada contra los fitopatógenos. Hasta ahora, se ha presentado muy poca información sobre el uso de nanopartículas de níquel estabilizadas con quitosano contra fitopatógenos43. Pero aún no se ha registrado información sobre la bioactividad del nanoconjugado de níquel y quitosano (NiCNC) contra el devastador patógeno Fusarium.

En nuestro presente estudio, sintetizamos nanoconjugados metálicos incorporando un metal de transición y un micronutriente esencial: el níquel dentro de una red de nanoquitosano mediante el desarrollo de reticulación de tripolifosfato y aplicamos lo mismo para el control de la pudrición del trigo por Fusarium. La aplicación del conjugado de nanoquitosano de níquel para el manejo de la pudrición por Fusarium en el trigo y la mejora del vigor de las plántulas a través de la capacidad de tolerancia al estrés patógeno es un enfoque novedoso. La comparación entre CNP y NiCNC nos ayudaría a reconocer el efecto promotor de los nanoconjugados metálicos (NiCNC) en el control de la pudrición por Fusarium sobre nanopartículas de quitosano (CNP) no conjugadas. En este contexto, se utilizó Mancozeb para comparar la eficacia del nanoquitosano sintetizado y del nanoquitosano complejado con níquel con fungicidas químicos sintéticos comerciales. Por lo tanto, los datos obtenidos de nuestro estudio ayudarán a investigar las medidas de control de la pudrición por Fusarium en otros cultivos a través de nanoconjugados de biopolímeros.

Como observación principal, la formación de CNP estuvo indicada por la aparición de una solución opalina y de color naranja amarillento para el hidrogel de NiCNC. Los resultados de la espectroscopia de absorción UV-visible mostraron un pico de absorción característico para CNP a 203 nm y NiCNC a 241 nm en la región UV. El análisis de CNP con microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HR-TEM) mostró nanopartículas finas de forma esférica de tamaño que oscilaban entre 21 y 124 nm (medidas a través del software ImageJ), mientras que NiCNC mostró un tamaño de partícula que oscilaba entre 300 y 400 nm. Tanto los CNP como los NiCNC mostraron aglomeraciones con una morfología de superficie rugosa entrelazadas entre sí, como se revela en el análisis de microscopía electrónica de barrido de emisiones de campo (FE-SEM). NiCNC mostró una morfología de nanodisco similar a una hoja hexagonal con bordes puntiagudos que se asemejan a la naturaleza altamente cristalina de la nanopartícula. El análisis del espectro de espectrometría de rayos X de dispersión de energía (EDXS) mostró la presencia de níquel en NiCNC, lo que lo confirma como una nanopartícula conjugada con metal. Todos los elementos necesarios fueron confirmados en los CNP. El análisis espectral de espectroscopía infrarroja transformada de Fourier (FT-IR) mostró posiciones de pico casi variadas de CNP y NiCNC sintetizados. El pico de absorción de FT-IR en 3302,56 y 3173,68 cm −1 de CNP y NiCNC, respectivamente, corresponde al grupo O – H y al grupo N – H de vibraciones de estiramiento. La banda de absorción en 1675,45 y 1628,22 cm-1 mostró la presencia de la banda de amida I en CNP y NiCNC, respectivamente. El pico obtenido a 1379,09 cm-1 indica la presencia de –C–O–H en vibraciones de flexión plana o –CH2 meneo o torsión en NiCNC. La banda de absorción en 1527,94 cm-1 se asemeja a las vibraciones de flexión N – H (amida II) en NiCNC, que está ausente en los CNP. El pico obtenido a 1275,63 cm-1 para los CNP indica la presencia de vibraciones de estiramiento P = O. Todos los picos obtenidos entre 400 y 600 cm-1 en el caso de NiCNC son picos característicos de las vibraciones de óxidos metálicos. El pico intenso a 576,93 cm-1 obtenido para NiCNC se debe a las vibraciones causadas por el enlace Ni-O (Fig. 1).

Imágenes de nanohidrogel de (a) CNP y (b) NiCNC obtenidas mediante el método de gelificación ionotrópica; Caracterización de CNP y NiCNC mediante (c) espectros UV-Vis de CNP y NiCNC; Análisis FE-SEM de (d) CNP y (e) NiCNC; Análisis HRTEM de (f) CNP y (g) NiCNC; Histograma de distribución del tamaño de partículas de (h) CNP y (i) NiCNC; Análisis EDXS de (j) NiCNC y (k) CNP y análisis FT-IR de (l) CNP y (m) NiCNC.

La actividad antifúngica de los CNP y NiCNC se evaluó determinando el diámetro de la colonia de F. solani cultivada en medio PDA tratado con diferentes concentraciones de ambas nanopartículas. Después de 7 días de incubación, se observó que, en comparación con los CNP, el NiCNC mostró resultados más eficientes con un menor diámetro de colonia. El diámetro de la colonia se redujo progresivamente al aumentar la concentración de CNP y NiCNC. El fungicida comercial Mancozeb en su dosis recomendada mostró actividad insignificante con respecto al NiCNC (p ≤ 0.05). La placa no tratada mostró un crecimiento completo de la colonia en 7 días (Fig. 2). Se observó una inhibición del 100% del crecimiento radial en el caso de NiCNC a 0,04 mg/mL, mientras que 0,04 mg/mL de CNP mostraron un 65,50% de inhibición del crecimiento. Por otro lado, Mancozeb mostró un porcentaje de inhibición de 52,90 en su dosis recomendada. La actividad antifúngica del NiCl2 a 0,04 mg/ml y 0,06 mg/ml resultó ineficaz contra el hongo objetivo. Ambas concentraciones de NiCl2 mostraron 28% y 32% de inhibición del crecimiento micelial.

Efecto de los CNP y NiCNC sobre el crecimiento radial del micelio de F. solani. (a) Crecimiento radial del micelio de F. solani con diferentes concentraciones (0,001, 0,01, 0,02, 0,03 y 0,04 mg/mL) de CNP y NiCNC en placa PDA; (b) Representación gráfica del diámetro de la colonia de F. solani con diferentes concentraciones de CNP y NiCNC en comparación con Mancozeb, NiCl2 y control a los 7 días después de la incubación; (c) Gráfico que muestra el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PIRG) de F. solani en concentraciones probadas de CNP y NiCNC. Los valores son promedios de tres réplicas (n = 3), las barras de error indican desviación estándar (SD) y letras diferentes (a, b, c, etc.) indican diferencia significativa entre tratamientos en p ≤ 0.05 según la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan.

Para aclarar mejor la actividad antifúngica de las nanopartículas, investigamos el porcentaje de inhibición de la germinación de las esporas. Cuando se observó bajo microscopio óptico después de 6 h de tratamiento, se observó una reducción notable en la germinación de esporas en el caso del tratamiento con NiCNC en comparación con las esporas no tratadas y tratadas con CNP. Cuando las esporas se exponen a 0,04 mg/mL de solución de NiCNC, mostró una inhibición del 100% de la germinación de las esporas, mientras que la dosis de Mancozeb mostró solo un 57,83% de inhibición de la germinación de las esporas. Por otro lado, el tratamiento con 0,04 mg/mL de CNP en esporas de F. solani mostró una inhibición del 89% de la germinación de las esporas. El valor de CI50 de los CNP y NiCNC se obtuvo como 0,021 y 0,019 mg/ml, respectivamente (Fig. 3).

Efecto de CNPs y NiCNC sobre el porcentaje de inhibición de la germinación de esporas de F. solani. (a) Imágenes microscópicas de la inhibición de la germinación de esporas de F. solani con diferentes concentraciones (0,001–0,04 mg/mL) de CNP y NiCNC en comparación con Mancozeb (16 mg/mL) y esporas no tratadas (control) (Aumento = 400×) ; (b) porcentaje de inhibición de la germinación de esporas de F. solani. Los datos se expresan como media ± DE (n = 3), letras diferentes indican diferencia significativa entre los tratamientos en p ≤ 0,05; (c) Valores IC50 de CNP y NiCNC.

El efecto de diferentes concentraciones de CNP y NiCNC durante 72 h sobre la supresión de la esporulación de F. solani reveló que el tratamiento con NiCNC mostró una disminución significativa en la formación de conidios con su rango creciente de concentraciones. La placa no tratada mostró 0,83 × 106 conidios/ml, mientras que NiCNC y CNP dieron como resultado la formación de 0,02 × 106 y 0,05 × 106 conidios/ml, respectivamente, a una concentración de 0,04 mg/ml. Por el contrario, la dosis de Mancozeb produjo 0,13 × 106 conidios/ml (fig. 4).

Efecto de las concentraciones probadas de CNP y NiCNC sobre la supresión de la esporulación de F. solani. (a) Recuento de esporulación en hemocitómetro observado bajo microscopio óptico; (b) Representación gráfica del efecto de los CNP y NiCNC en comparación con Mancozeb y esporas no tratadas (control) sobre la formación de conidios; Los valores son promedios de tres réplicas (n = 3), las barras de error indican DE y letras diferentes (a, b, c, etc.) indican diferencias significativas entre tratamientos en p ≤ 0,05.

Las esporas tratadas con NiCNC resultaron menos viables con un porcentaje de viabilidad de 13 a 0,04 mg/ml, en comparación con las esporas no tratadas que mostraron una viabilidad del 90 %. El tratamiento con CNPs (0,04 mg/mL) mostró un 28% de esporas viables en el medio. Las esporas cultivadas con Mancozeb (16 mg/mL) mostraron un 56% de esporas viables (Fig. 5a).

Efecto de diferentes concentraciones de CNP y NiCNC sobre (a) porcentaje de viabilidad de esporas y (b) porcentaje de MDA de F. solani; Observaciones microscópicas de fluorescencia que muestran la generación de estrés oxidativo en conidios y micelio de F. solani debido al efecto de (c) NiCNC (0,04 mg/mL), (d) CNP (0,04 mg/mL), (e) Mancozeb (16 mg/mL). mL) y (f) micelio no tratado; cambios morfológicos de los conidios de F. solani expuestos directamente a (g) NiCNC (0,04 mg/mL), (h) CNP (0,04 mg/mL), (i) Mancozeb (16 mg/mL) y (j) agua destilada observados bajo microscópio electrónico escaneando.

La concentración más alta utilizada de NiCNC produce 77,77% de malonaldehído (MDA) en los hongos, mientras que los hongos no tratados tienen 0,00% de MDA. Por otro lado, los CNP producen un máximo de 38,66% de MDA cuando los hongos se trataron con concentraciones de 0,04 mg/ml (Fig. 5b). Por el contrario, el tratamiento con Mancozeb presentó un 32,00% de MDA.

El nivel de ROS generado en el sistema fúngico después de 72 h de aplicación de nanopartículas se midió mediante el método de tinción DCFH. La Figura 5c-f muestra imágenes observadas bajo un microscopio de fluorescencia relacionadas con el nivel de ROS generado en micelio fúngico tratado con NiCNC, CNP y Mancozeb no tratado. Nuestro presente estudio mostró la generación de una mayor intensidad de fluorescencia en el micelio fúngico tratado con NiCNC seguido de un tratamiento con CNP y Mancozeb que muestra una intensidad moderada de fluorescencia. No se observó expresión de fluorescencia para el micelio fúngico no tratado.

La aplicación de nanopartículas sintetizadas durante 72 h alteró la morfología de los conidios de F. solani. Ambas nanopartículas han inducido una depresión pronunciada en la morfología de los conidios, lo que resulta en una distorsión completa y un daño severo de la membrana. Los conidios fúngicos no tratados mostraron una morfología superficial uniforme bien desarrollada sin anomalías estructurales. El tratamiento con mancozeb resultó en una ligera depresión en la superficie de los conidios en comparación con los conidios no tratados; de lo contrario, no hubo diferencias significativas (Fig. 5g-j).

Al final del día 20, los síntomas en las plántulas inoculadas se analizaron según la escala de 5 niveles de Santori e Infantino (2009) (Tabla 1). Se observó una reducción significativa en la incidencia de enfermedades en las plántulas tratadas con NiCNC en comparación con las plántulas no tratadas. Las plántulas no tratadas mostraron un 93,33% de incidencia de enfermedades con coloración marrón oscura del tallo y la porción de raíz de la plántula. También se observaron en la bandeja un 36,66% de plantas muertas después de 20 días que no pudieron sobrevivir después de la infección. Pero las plántulas tratadas con NiCNC mostraron un vigor casi saludable con sólo un 16,67% de infección. Tanto el tratamiento con CNP como con Mancozeb mostraron una cantidad moderada de infección, 50% y 53,33%, respectivamente, en las plántulas (Fig. 6a-h).

Síntomas de la enfermedad de plántulas de trigo no inoculadas e inoculadas con F. solani el día 20, expuestas a (a,b) agua destilada (sin tratar), (c,d) CNP (0,04 mg/mL), (e,f) NiCNC (0,04 mg /mL) y (g,h) Mancozeb (16 mg/mL); (i) sección longitudinal del tallo de la plántula enferma tratada con agua destilada e inoculada con F. solani y (j) plántula tratada con NiCNC e inoculada con F. solani. Se observó que las hifas infecciosas se ramificaban sólo dentro de los tejidos de las plántulas no tratadas.

Para una mayor confirmación de la incidencia de la enfermedad en las plántulas, se realizaron secciones anatómicas de la porción del tallo de las plántulas cultivadas en suelo inoculado, tanto enfermas no tratadas como tratadas con NiCNC. Bajo el microscopio se observó que las plántulas enfermas mostraban células de color marrón, sin clorofila y con una presencia prominente de clavija de infección o apresorio que se diferenciaban para formar hifas infecciosas primarias que luego se convertían en hifas invasivas. Además, estas células mostraban una pared celular totalmente alterada. En contraste con esto, las plántulas tratadas con NiCNC mostraron células frescas, verdes y sanas con una pared celular intacta (Fig. 6i-j).

Entre todos los tratamientos, las plántulas con tratamiento NiCNC mostraron mayor índice de vigor. Se observó un vigor moderado en las plántulas tratadas con CNP. Se observó vigor retardado con brotes y raíces cortos en el caso de las plántulas tratadas con Mancozeb. Se observó un patrón de vigor normal en las plántulas no tratadas (Fig. 7a, b). El efecto del tratamiento con CNP y NiCNC en la mitigación del estrés patógeno sobre el vigor de las plántulas se evaluó a través del índice de tolerancia al estrés en altura de la planta y longitud de la raíz. Las plántulas inoculadas con F. solani y tratadas adicionalmente con 0,04 mg/mL de NiCNC mostraron un índice máximo de tolerancia al estrés en altura de la planta y longitud de la raíz. Las plántulas inoculadas tratadas con CNP mostraron un índice de tolerancia al estrés moderado de la altura de la planta y la longitud de las raíces. Las plántulas inoculadas tratadas con Mancozeb mostraron un índice de tolerancia al estrés más bajo que ambas nanopartículas aplicadas. Las plántulas inoculadas con F. solani sin ningún tratamiento mostraron la menor tolerancia al estrés patógeno entre todos los tratamientos (Fig. 7c-e).

(a) Observación del vigor morfológico de plántulas de trigo inoculadas con F. solani al día 20 tratadas con agua destilada, CNP, NiCNC y Mancozeb; (b) porcentaje de incidencia de enfermedades de plántulas de trigo tratadas de forma variable; (c) Altura de la planta y (d) Índice de tolerancia al estrés en la longitud de la raíz de plántulas de trigo inoculadas con F. solani tratadas con agua destilada (sin tratar), CNP, NiCNC y Mancozeb; (e) Índice de vigor de plántulas de trigo no inoculadas e inoculadas con F. solani al día 20. Los valores son promedios de tres réplicas (n = 3), las barras de error indican DE y letras diferentes (a, b, c, etc.) indican diferencias significativas entre tratamientos en p ≤ 0,05.

Se expuso una línea celular de mamíferos a un rango de concentraciones crecientes (0,01 a 0,4 mg/ml) de CNP y NiCNC para evaluar su porcentaje de citotoxicidad en cada concentración. Los resultados indican claramente el hecho de que en un rango más bajo de concentraciones de 0,01 a 0,250 mg/ml, ambas nanopartículas no muestran ningún efecto tóxico para las células sembradas. Las células no se vieron afectadas por el tratamiento de las nanopartículas y se reprodujeron de forma saludable. Por lo tanto, la viabilidad celular se mantuvo sin cambios en presencia de ambas nanopartículas. Pero a medida que la concentración de ambas nanopartículas aumenta a 0,3 mg/ml, las células se alteran para dar una respuesta negativa y provocan incapacidad reproductiva de las células renales.

En relación con la minimización del impacto negativo de los fungicidas sintéticos en el medio ambiente y la salud pública, el uso de productos biológicos naturales como el quitosano está ganando cada vez más atención en el mundo de la investigación. El quitosano se considera un potente agente quelante que puede formar fácilmente complejos con metales de transición y metales pesados44. Varios investigadores se han centrado en la aplicación del complejo quitosano-metal en el secuestro de iones metálicos, teñido, tratamiento de agua, catálisis y otras aplicaciones industriales. Sin embargo, un informe sugiere que el complejo quitosano-metal con iones bivalentes (Cu, Zn, Ni, Fe) imparte una actividad antipatógena prometedora que el quitosano a granel o las sales metálicas libres debido a los cambios estructurales alterados en la molécula de quitosano que tiene -NH2 y -OH. como sitios reactivos dominantes45. Se sabe que el quitosano y el nanoquitosano inhiben un amplio espectro de hongos patógenos, como Alternaria solani, F. oxysporum, Aspergillus niger, Penicillium spp., Candida spp., Cordyceps militaris, etc.46,47,48.

El uso de nanoconjugado de níquel y quitosano para combatir la pudrición por Fusarium en el trigo ha dado como resultado una reducción significativa de la incidencia de enfermedades en un 83,33%. En un examen in vitro, NiCNC a 0,04 mg/ml mostró una terminación completa del crecimiento de la colonia de hongos en la placa PDA. Se observó que con el aumento gradual de la concentración de NiCNC, el diámetro de la colonia fúngica disminuye. Esto confirma la actividad dosis dependiente de las nanopartículas metálicas como lo sugieren diferentes autores49,50. Nuestro resultado sugiere que NiCNC tuvo un efecto antifúngico más significativo sobre F. solani que una dosis de Mancozeb y concentraciones probadas de CNP. Mancozeb redujo el crecimiento del micelio fúngico en un 53%. Es un fungicida ditiocarbamato, clasificado por el Comité de Acción de Resistencia a los Fungicidas (FRAC) de acción multisitio51. Se informa que los fungicidas sintéticos como Mancozeb tienen numerosos fallos de funcionamiento en organismos modelo mamíferos52. Afecta de forma aguda a la fertilidad masculina, problemas gastrointestinales, picazón de garganta, irritación, estornudos, tos, bronquitis y absorción transdérmica53,54. La información sobre la toxicidad potencial de Mancozeb y otros fungicidas químicos similares no debería respaldar su uso en campos agrícolas, especialmente en los principales cultivos alimentarios consumidos a nivel mundial, como el trigo. Ha estado revocado en la Unión Europea desde 2021, aunque se utiliza ampliamente en diferentes países del sudeste asiático55. Por otro lado, 0,04 mg/mL de CNP mostraron un 65,50% de inhibición del crecimiento, lo que concluye que es un agente antifúngico menos eficiente que el NiCNC. Varios investigadores ya han descrito que los efectos inductivos de las nanopartículas metálicas o de los complejos quitosano-metal sobre diferentes fitopatógenos son más eficientes56,57,58,59. Se encontró que la actividad antifúngica de la solución de NiCl2 a granel a 0,04 mg/ml y 0,06 mg/ml era incompetente contra el crecimiento de F. solani. Incluso a una concentración más alta de 0,06 mg/ml de NiCl2, el patógeno objetivo prospera con un notable crecimiento de colonias. Es una indicación clara de que el NiCl2, cuando se inyecta con nanoquitosano, imparte una actividad antifúngica potencial en las concentraciones antes mencionadas60. La aplicación del nanocompuesto Ag-quitosano contra Fusarium spp. mostró una acción inhibidora completa a 1 mg/mL mientras que, en nuestro estudio, NiCNC mostró una inhibición completa de F. solani a una dosis muy baja (0,04 mg/mL)28. Una revisión exhaustiva del trabajo anterior apoya firmemente la idea de que el ion Ni2+ al ser absorbido por el quitosano mostró un efecto inhibidor mejorado contra varios patógenos vegetales61.

NiCNC puede inhibir con éxito la germinación de esporas de F. solani a 0,04 mg/ml. Las esporas son la unidad propagativa más pequeña de cualquier hongo patógeno que conduce al establecimiento exitoso de la enfermedad en la planta huésped62. La germinación de esporas es muy crucial para el desarrollo vegetativo y reproductivo del patógeno. La germinación de esporas es muy sensible al estrés abiótico, al estrés nutricional y a las comunicaciones huésped-patógeno63. La terminación completa del proceso de germinación de esporas con la concentración más alta probada de NiCNC lo define como un potente agente esporicida contra F. solani. A partir de los resultados obtenidos, fue evidente que NiCNC exhibió una actividad antifúngica más fuerte que los CNP y Mancozeb, como encontramos en el caso del crecimiento de colonias radiales.

Diversos investigadores en sus estudios previos han recomendado el uso de nanopartículas metálicas y de óxidos metálicos como agente antifúngico64. El trabajo realizado por Wani y Shah en 201265 reveló que había una inhibición significativa de la germinación de esporas en patógenos como Fusarium oxysporum, Alternaria alternata y Rhizopus stolonifer cuando sus esporas se trataban con nanopartículas de óxido de magnesio y óxido de zinc. Más específicamente, la absorción del ion Ni2+ en el quitosano afecta en gran medida la inhibición del crecimiento de Candida albicans66. Evidentemente, el NiCNC puede apuntar a la formación de conidios cuando se expone a la concentración más alta probada en un medio de esporulación adecuado. Se puede suponer que la interacción directa entre el complejo quitosano-metal y las hifas altera la estructura de las proteínas celulares y su naturaleza química, algunas de las cuales están involucradas en la formación de conidióforos67. Además, los resultados de nuestro experimento están de acuerdo con el resultado obtenido por Ahmed et al. (2016)57 donde dilucidaron que las nanopartículas de níquel mostraron un aumento significativo en la actividad esporicida contra especies de Fusarium a 50 ppm.

El ensayo colorimétrico del hidróxido de [2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenil-amino)carbonil]-2H-tetrazolio XTT se desarrolló originalmente para verificar las propiedades vegetativas y reproductivas. viabilidad de algunos hongos clínicamente importantes como Candida spp., Saccharomyces cervisiae, Penicillium chryogenum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Trichoderma atroviride68. A veces, la determinación de la concentración inhibidora mínima para los hongos se vuelve difícil debido al crecimiento no homogéneo de hifas y filamentos. Se sabe que esta cuantificación colorimétrica del crecimiento fúngico es más precisa y exacta. Este ensayo es conocido por lograr una inhibición completa de las actividades metabólicas dentro de los hongos patógenos, como resultado de lo cual la germinación de las esporas y su viabilidad se ven afectadas69,70. Evidentemente se observó que con el aumento de la dosis de NiCNC, el porcentaje de viabilidad de la espora disminuye. Nuestros resultados respaldan firmemente los resultados obtenidos por Ghasemian et al. (2012) donde mencionaron que las nanopartículas metálicas son efectivas para reducir el porcentaje de viabilidad de las esporas, particularmente, para Fusarium solani y 60 mg/mL (concentración mínima inhibidora) de nanopartículas de cobre resultaron efectivas como agente esporicida, como lo demostraron ellos68. Está demostrado que la interacción electrostática entre las cargas positivas de los nanoconjugados y los componentes celulares fúngicos cargados negativamente conduce a la desestabilización de la membrana y a la fuga protoplásmica celular, lo que resulta en esporas no viables38,71.

El efecto de NiCNC y CNP sobre la peroxidación lipídica de hongos se evaluó determinando los niveles de MDA producidos como resultado de la generación de estrés intracelular debido a la aplicación de nanopartículas. Los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la membrana fúngica contienen un grupo metileno (–CH2–) que se ve afectado negativamente por la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y, por lo tanto, provoca la peroxidación de los lípidos. Este fenómeno de peroxidación lipídica altera completamente la integridad de la membrana fúngica y produce un subproducto aldehído MDA, un indicador de peroxidación lipídica. Esta MDA producida reaccionará con la 2'-desoxiguanosina (M1G-dR) presente en el ADN del hongo para formar un aducto de propano. Este proceso influye significativamente en el metabolismo fúngico al afectar diversas funciones fisiológicas de la célula, incluida la señalización celular, su crecimiento y proliferación, diferenciación y apoptosis72. En el presente estudio, se encontró que los niveles de MDA en los hongos aumentaban con las concentraciones crecientes de NiCNC en comparación con el control. La elevación de los niveles de MDA se debe al efecto nocivo de las ROS generadas como resultado de su interacción con los lípidos de la membrana del hongo. Nuestro estudio demostró el máximo efecto perjudicial del tratamiento con NiCNC sobre la integridad celular de los hongos en comparación con los CNP y Mancozeb.

La intensidad de la fluorescencia observada en los micelios y conidios de los hongos es directamente proporcional al nivel de ROS generado debido al estrés por la exposición a nanopartículas73,74. El hecho de que las nanopartículas metálicas puedan producir considerablemente más ROS intracelular que sus contrapartes en masa puede concluirse a través de nuestro experimento75. Se observa en nuestro estudio que 0,04 mg/mL de NiCNC produce estrés oxidativo máximo en micelio y conidios fúngicos por la emisión de alta intensidad de fluorescencia, mientras que CNPs (0,04 mg/mL) y Mancozeb (16 mg/mL) producen estrés moderado. intensidad de la fluorescencia. Se puede afirmar claramente que el NiCNC podría generar un estrés oxidativo máximo en el sistema fúngico en comparación con los CNP y los fungicidas sintéticos. Las ROS producidas debido al tratamiento con nanopartículas metálicas pueden obstaculizar completamente la integridad y funcionalidad de la membrana de los hongos, provocando así una inhibición del crecimiento y también la muerte72. En un estudio, se ilustró que el incremento en el nivel de ROS puede desequilibrar el nivel de oxidantes y antioxidantes, lo que resulta en un alto estrés oxidativo seguido de la liberación de citocromo C que conduce a la apoptosis celular76. Se ha demostrado que la aglomeración de metales en quitosano contra F. oxysporum genera una alta intensidad de fluorescencia que respalda firmemente nuestro estudio38.

Tanto el tratamiento con NiCNC como con CNP en conidios fúngicos ha dado lugar a daños irreversibles graves en la membrana conidial, incluidos extremos rotos con aumento de la permeabilidad de la membrana y diversas anomalías de la superficie analizadas mediante SEM. La aplicación de NiCNC sobre los conidios da como resultado la pérdida de su contenido protoplásmico seguido de una fuga celular y parece conidios perforados. Este resultado fue totalmente compatible con los resultados obtenidos por Dananjaya et al. (2017) sobre el tratamiento de nanopartículas de quitosano de plata contra F. oxysporum donde han observado daños en la pared celular y alteración en la permeabilidad de la membrana. Anteriormente se confirmó que las nanopartículas de óxido metálico podrían acoplarse a la superficie de las bacterias patógenas77.

Los experimentos in vivo revelaron que 0,04 mg/ml de NiCNC proporcionan la máxima protección contra el ataque de F. solani en las plántulas de trigo en desarrollo. Este conjugado quitosano-metal pudo reducir la incidencia de la enfermedad al 16,67%. Esta concentración puede considerarse para la inducción de resistencia en plántulas de trigo contra la pudrición. Los investigadores ya han establecido el papel biológico del quitosano y sus nanopartículas como inductor de resistencia contra el ataque de hongos, más concretamente contra Fusarium spp.78. Varios informes sugieren que el quitosano en sí es eficaz para desencadenar la inmunidad innata de las plantas al mostrar un bajo grado de gravedad de los síntomas79. Los científicos han afirmado que el tratamiento con quitosano y sus nanoderivados podría mejorar significativamente la resistencia a las enfermedades entre las plántulas durante las etapas de germinación80. Además, los conjugados metálicos de nanoquitosano podrían mejorar aún más la capacidad de resistencia a enfermedades según lo evaluado a partir del atributo de incidencia de enfermedades de nuestro estudio.

No sólo para la prevención de la pudrición, sino que el tratamiento con NiCNC puede estimular eficazmente el índice de vigor de las plántulas. Las plántulas tratadas con NiCNC son más altas con hojas verdes sanas y raíces de mayor longitud que las plántulas tratadas con fungicidas sintéticos, CNP y agua destilada. Las plántulas tratadas con fungicidas sintéticos mostraron un bajo índice de vigor debido a un crecimiento retardado con una altura de planta corta y raíces más pequeñas que podrían representar el efecto fitotóxico del fungicida sobre las plántulas. Esto confirma la actividad promotora del crecimiento vegetal de las nanopartículas de quitosano y sus derivados. Se sabe que el quitosano es un regulador del crecimiento de las plantas que mejora la biomasa de la planta al disminuir la tasa de transpiración. En los últimos tiempos, los investigadores han prestado gran atención al mecanismo por el que las nanopartículas basadas en quitosano promueven el crecimiento de las plantas81,82. Se demostró que las nanopartículas de quitosano podrían aumentar significativamente el crecimiento de las plántulas mediante la absorción de nutrientes enriquecidos que incluyen nitrógeno, potasio, calcio, fósforo y magnesio83. Más precisamente, se podría concluir que el quitosano y sus nanoderivados promueven el crecimiento de plántulas de trigo en germinación mediante la activación de la vía de señalización IAA84,85. Los resultados obtenidos de nuestro estudio están de acuerdo con los hallazgos de autores anteriores y se podría sugerir que el tratamiento con nanopartículas de quitosano y sus derivados metálicos podría mejorar activamente el crecimiento de las plántulas de trigo bajo exposición a estrés biótico. Los investigadores han llegado a la conclusión de que el tratamiento con nanopartículas a base de quitosano contribuyó a incrementar 1,5 veces la longitud de las raíces y los brotes de las plantas86. Este incremento fue evidente en nuestro estudio, mostrando una mayor altura de la planta después del tratamiento con NiCNC en comparación con las plántulas no tratadas, tratadas con CNP y Mancozeb (Fig. 7e).

También se sabe que el ion Ni2+ contribuye a la proliferación vegetativa de los cultivos y su deficiencia puede dar lugar a un crecimiento vegetativo reducido, una mayor senescencia de las plantas, alteraciones del metabolismo del nitrógeno, desarrollo de clorosis, enanismo del follaje, mala arquitectura de las plantas y obstáculos en la absorción normal de Fe87. . Un menor nivel de exposición al níquel de las plantas mejora la germinación de las semillas, la síntesis de clorofila y la formación de raíces laterales. Las investigaciones revelaron que el níquel tiene un papel destacado en la síntesis de fitoalexinas y la inducción de resistencia a enfermedades en las plantas88. Como se mencionó anteriormente en la parte introductoria, ese ion Ni2+ sirve como cofactor de diferentes metaloenzimas como la ureasa, monóxido de carbono deshidrogenasa, etc. Por lo tanto, es evidente que el níquel es un micronutriente esencial requerido en menor concentración para el funcionamiento normal del planta y la fusión de níquel con quitosano puede mejorar su bioactividad cuando se aplica a las plantas. La literatura revela que las plantas de cultivo requieren un promedio de 3 a 1000 mg de Ni/kg de suelo agrícola necesarios para un crecimiento y funcionamiento normales sin ningún efecto tóxico89. En nuestro experimento, la concentración bioactiva más alta probada, es decir, 0,04 mg/ml de solución de hidrogel de NiCNC, en realidad contiene 38 % de Ni (estimado mediante análisis EDXS), lo que representa un aproximado de 0,00668 mg/ml de Ni aplicado a cada plántula. Los experimentos se realizaron en bandejas de plástico que contenían 5 kg de tierra para 30 plántulas. A cada plántula se le dio un tratamiento de 5 mL de solución de NiCNC, por lo tanto, para 30 plántulas se aplicaron 150 mL de NiCNC en 5 kg de suelo. Ahora, 150 ml de NiCNC contendrían (0,00668 mg/mL × 150 ml) 1,002 mg/mL de Ni en 5 kg de suelo (0,2 mg/mL de Ni por kg de suelo), lo cual es una dosis extremadamente baja y no tiene posibilidades de toxicidad y acumulación de metales en el suelo42. Por lo tanto, el nanoconjugado de níquel-quitosano sintetizado puede considerarse un agente antifúngico no tóxico y ecológico43.

El análisis de tolerancia al estrés de las plántulas inoculadas con F. solani reveló que la aplicación de NiCNC induce una mayor capacidad de tolerancia al estrés patógeno al acelerar la altura de la planta y la longitud de las raíces. Se sabe que el estrés causado por una infección patógena en las plantas puede desencadenar la altura de las plantas y afectar la proliferación de las raíces, lo que resulta en un retraso en el crecimiento. Las plántulas tratadas con agua destilada no pudieron resistir el estrés patógeno resultando en plantas muertas. Mientras que las plántulas tratadas con CNP mostraron una capacidad de tolerancia al estrés moderada en comparación con el tratamiento con NiCNC. Las plántulas tratadas con mancozeb dieron como resultado una menor tolerancia al estrés patógeno junto con el tratamiento con CNP. Nuestro estudio sugiere que la actividad del fungicida sintético no puede combatir con éxito la pudrición y la invasión de patógenos. Más bien, el uso excesivo de fungicidas sintéticos puede provocar toxicidad en las plantas, el suelo y el medio ambiente36. Los resultados obtenidos de este estudio demuestran claramente el efecto promotor del ion metálico (Ni2+) insertado en la malla de quitosano. La importancia de la inserción de iones de níquel en la red de quitosano es obtener una mayor actividad promotora del crecimiento de las plántulas de trigo y aumentar la actividad antipatógena sobre el quitosano a granel.

Nuestros experimentos sugieren fuertemente que NiCNC podría eliminar activamente el efecto negativo del patógeno en las plántulas de trigo contra la pudrición. Por tanto, la conformación estructural de NiCNC se vuelve importante con respecto a su actividad antifúngica. La formación de nanopartículas mediante el método de gelificación ionotrópica es ventajosa porque no utiliza disolventes orgánicos y las condiciones de procesamiento son suaves, lo que no permite provocar ni un pequeño cambio en la estructura del fármaco encapsulado90. La espectroscopia de absorción UV-visible mostró un pico de absorción característico para NiCNC a 241 nm en la región UV, que se asemeja mucho a la formación de nanopartículas como se describe en informes anteriores91. Un tamaño de partícula más pequeño de la nanopartícula es ventajoso debido a su capacidad de fácil penetración y mayor capacidad de absorción celular92,93. Las partículas de NiCNC mostraron un tamaño que oscilaba entre 300 y 400 nm. Según algunos informes anteriores, un tamaño de partícula inferior a 500 nm es suficiente para una fácil penetración en la pared celular de los hongos94,95,96,97. Un grupo de trabajadores ya sugirió que los CNP permanecen en forma de nanoagregados, como se indica en la Fig. 1f 98. Además, el análisis EDXS de NiCNC mostró la presencia de Ni en la red de quitosano, lo que confirmó la formación de nanocompuestos metálicos a través de interacciones electrostáticas. entre los grupos hidroxilo del quitosano y la sal metálica involucrada. Este patrón de estructura del NiCNC ya fue confirmado en estudios previos realizados por diversos investigadores99. El análisis FE-SEM reveló aglomeraciones tanto de CNP como de NiCNC. Este criterio particular de los CNP facilita la exposición de una gran superficie, lo que le permite ser un material de fácil adsorción100. De manera similar, NiCNC mostró nanopartículas aglomeradas altamente porosas distribuidas uniformemente. Estas aglomeraciones o formación de nanoagrupaciones y la naturaleza porosa del NiCNC los convierten en biomoléculas útiles con excelentes propiedades de adsorción y otras aplicaciones en el campo de la nanomedicina101. El análisis FT-IR mostró la participación de grupos funcionales esenciales que desempeñan un papel activo en la actividad antifúngica102.

Los resultados del ensayo de citotoxicidad no muestran ninguna diferencia significativa con el aumento de las concentraciones de CNP y NiCNC hasta 0,25 mg/ml en comparación con el control no tratado (Fig. 8). Ambas nanopartículas resultaron citotóxicas a partir de 0,3 mg/ml y más. Se observó una diferencia significativa en el porcentaje de citotoxicidad con 0,4 mg/ml. El mayor porcentaje de citotoxicidad observado para NiCNC puede deberse a la participación de iones metálicos en la nanopartícula38. El análisis de citotoxicidad sugiere que los CNP y NiCNC no son tóxicos para las células ACHN hasta 0,25 mg/ml, mientras que la dosimetría antifúngica bioactiva aplicada a plántulas de trigo contra F. solani fue de 0,04 mg/ml, que es mucho menor que la dosis tóxica. Por lo tanto, la dosis aplicada de NiCNC no es tóxica para las células humanas y puede utilizarse en campos agrícolas para los principales cultivos alimentarios consumidos a nivel mundial, como el trigo.

Comparación de la citotoxicidad de CNP y NiCNC en células ACHN de mamíferos. La toxicidad celular se evaluó en función del porcentaje de citotoxicidad con diferentes concentraciones de CNP y NiCNC (0,01–0,4 mg/ml). Los datos se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). La marca de asterisco indica valores medios significativamente diferentes (p ≤ 0,05) entre los tratamientos con CNP y NiCNC.

Los investigadores han esclarecido varios conceptos para describir el modo de acción del quitosano y sus derivados al exhibir actividad antifúngica. Afirmaron que la actividad fungicida podría deberse a la interacción entre las moléculas de quitosano cargadas positivamente y los componentes de la superficie de las células fúngicas cargados negativamente, lo que conduce a una mayor permeabilidad de la membrana después de un desequilibrio iónico103. También se recomienda que el quitosano, cuando ingresa a la célula fúngica, interactúe con el ADN alterando su estructura, inhibiendo así la síntesis de ARNm y proteínas104. Además, el quitosano tiene una excelente capacidad de unión a metales y se sabe que quela los iones metálicos que son esenciales para el crecimiento microbiano. Los grupos amino del quitosano policatiónico son responsables de la captación de iones metálicos105. Se supone que el ion metálico de transición níquel forma una estructura reticular tetraédrica centralmente localizada con los grupos amina cargados positivamente del quitosano106. Este núcleo metálico súper positivo en la red de quitosano es responsable de la actividad antifúngica promotora mediante la disolución del ion níquel que interrumpe el transporte de electrones en la célula patógena y provoca la desestabilización de la membrana, la fuga protoplásmica seguida de la muerte de los hongos107 (Fig. 9).

Ilustración esquemática del mecanismo de acción del nanoconjugado de níquel y quitosano contra patógenos fúngicos.

Existen otras estrategias de manejo que se utilizan para controlar la infección por pudrición por Fusarium en plantas de cultivo. Los investigadores han utilizado a menudo agentes de biocontrol como Trichoderma sp., Bacillus plumiles y aislados específicos de Streptomyces que reducen la incidencia de la pudrición entre un 66% y un 75%108,109. Estos agentes de biocontrol reducen, pero no erradican por completo, la población de plagas ni promueven el crecimiento de las plantas. Además, el uso de botánicos esenciales como extractos de Azadirachta sp., Zingiber sp. y los productos botánicos a base de mostaza mostraron una mayor eficacia para inhibir el crecimiento micelial de F. solani110. Pero para la aplicación de campo a gran escala, es necesaria una formulación prometedora con estabilidad y actividad antifúngica prolongada, especialmente contra las ascosporas111. En este sentido, el uso de nanoconjugado de níquel y quitosano es ventajoso porque facilita una mayor capacidad de reducción de enfermedades con una mejor salud de las plántulas, realiza la erradicación completa del patógeno bajo examen in vitro y podría retener una actividad antifúngica prolongada. Sin embargo, aún es necesario estudiar su aplicación de campo a gran escala.

Los CNP y NiCNC se sintetizaron con éxito mediante el método de gelificación ionotrópica y se caracterizaron en función de sus diversas propiedades fisicoquímicas. La aplicación de NiCNC exhibió una potencial propiedad de inhibición del crecimiento contra F. solani y controló eficientemente la incidencia de la pudrición (bajo condiciones específicas de laboratorio). El tratamiento con NiCNC a 0,04 mg/ml detiene completamente el crecimiento de la colonia micelial, inhibe la germinación de esporas y la formación de conidios. La exposición de NiCNC a los conidios del hongo produce daños ultraestructurales que dan como resultado esporas no viables. El tratamiento con NiCNC produce un alto nivel de MDA en el patógeno, lo que resulta en un aumento de la peroxidación lipídica de los hongos. El uso de CNP y del fungicida sintético Mancozeb no puede combatir eficazmente la pudrición. Nuestros datos recomiendan que NiCNC podría usarse como agente antifúngico en el manejo de la pudrición causada por F. solani. El tratamiento con NiCNC generó un alto nivel de estrés oxidativo en el patógeno que finalmente puso fin a la ramificación del patógeno en el sistema vegetal. Además, la aplicación con NiCNC podría potencialmente acelerar el índice de vigor de las plántulas a pesar de la exposición al estrés biótico. La concentración de níquel en el conjugado sintetizado fue mínima y demostró no ser tóxico para las plántulas de trigo mediante pruebas de citotoxicidad y al promover un vigor saludable de las plántulas. Sin embargo, se requieren más estudios para investigar el efecto del NiCNC sobre los patógenos del trigo mediante su aplicación en el campo.

La preparación de CNP se llevó a cabo siguiendo el método de gelificación ionotrópica38. Brevemente, se disolvieron 0,2 g de quitosano de bajo peso molecular (50 000–190 000 Da; 80 % de N-desacetilación; Producto 448 869; Sigma Aldrich, EE. UU.) en una solución de ácido acético al 1 % (v/v) y se dejaron en agitación continua durante 30 minutos. . Se añadió gota a gota una sal aniónica, tripolifosfato de sodio (STPP) (Na5P3O10; código HSN: 28,353,100; SRL, India) a una concentración de 1 mg/ml (40 ml) a la solución de quitosano bajo agitación magnética constante (REMI Equipments). . Se formó espontáneamente una suspensión turbia que dio lugar a la formación de NP y se sometió a centrifugación a 10.000 rpm. Se descartó el sobrenadante y el sedimento de gel de CNP se secó al sol y se almacenó a 4 \(^\circ\)C para su uso posterior.

Los NiCNC se prepararon siguiendo el método descrito por Helen & Rani (2016) con modificaciones menores43. Su síntesis se llevó a cabo añadiendo gota a gota una solución acuosa al 4% de cloruro de níquel (NiCl2.6H2O; RM760; Himedia, India) bajo agitación magnética constante en una solución de quitosano. La solución se llevó a reflujo a 120 °C durante 15 min. A esto se añadió ácido ascórbico 0,05 M (C6H8O6; PM 176,12; CMS1014; Himedia, India) seguido de la adición de 2 ml de NaOH 0,6 M. Después de agitar más durante 30 minutos, se agregaron a la solución 0,5 ml de fenilhidrazina (C6H6N2Cl2.HCl; RM9448; Himedia, India). La reacción se llevó a cabo adicionalmente mediante la adición gota a gota de STPP con agitación constante seguido de centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y se obtuvo el sedimento en forma de gel.

La absorbancia espectral UV-Vis de CNP y NiCNC se recolectó utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (Aligent Technologies, Carry 100 UV-Vis) con un rango de escaneo de 200 a 800 nm de longitud de onda. La morfología de los CNP y NiCNC se examinó mediante HR-TEM realizado en un JEOL JEM 2100F con un aumento de 50x – 1,5 Mx y un potencial de aceleración de 200 kV. La topografía de la superficie de las nanopartículas se examinó mediante el microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Schottky JSM-7900F (FE-SEM); JEOL, 0,1–30 kV. La presencia de elementos como boro, especialmente para NiCNC, también se determinó utilizando EDXS. Los grupos funcionales presentes en las nanopartículas se detectaron mediante análisis FT-IR dentro del rango de escaneo de 500 a 4000 cm-1 utilizando la técnica de pellets de KBr. Antes de realizar el análisis FT-IR, las nanopartículas se secaron al sol y se trituraron hasta obtener un polvo fino con un mortero. Durante el análisis, se trituraron 300 mg de KBr seco y se mezclaron con 2 mg de nanopartículas previamente secas y se colocaron en un recipiente para muestras sin grasa. Se preparó y utilizó una mezcla homogénea de KBr y nanopartículas para el análisis espectral de muestras.

Se recolectaron plántulas enfermas que tenían síntomas típicos de pudrición del tallo y del pie del trigo de campos de cultivo de trigo del norte de Bengala, India, para aislar el patógeno objetivo. Se obtuvieron permisos de los agricultores para la recolección de partes de plantas enfermas. Se extirpó el tallo enfermo de aproximadamente 1 cm, se esterilizó la superficie y se colocó en placas de Petri estériles que contenían 20 ml de medio de agar patata dextrosa (PDA) esterilizado en autoclave. Las placas se incuban durante 7 días a 28 \(^\circ\)C. Después de 7 días, el aislado se subcultivó varias veces para obtener placas de cultivo puro. El cultivo puro se envió al IARI (Instituto Indio de Investigación Agrícola, Nueva Delhi, India) para su identificación y se informó que el patógeno era Fusarium solani (ID No. 11116.19). Los cultivos puros se mantuvieron en inclinaciones de PDA a 28 \(^\circ\)C para su uso posterior en experimentos112.

Las actividades antifúngicas de los CNP y NiCNC sobre el crecimiento radial del micelio de F. solani se determinaron mediante la técnica de alimentos envenenados38. Se mezclaron un rango de concentraciones (0,001, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 mg/ml) de CNP y NiCNC con 20 ml de medio de agar patata dextrosa (PDA) esterilizado en autoclave. Se cortó un disco de micelio de 5 mm de diámetro utilizando un sacacorchos afilado y estéril de un cultivo esporulado de F. solani de 7 días de edad cultivado en medio PDA y se sembró en el centro de cada placa de tratamiento. Cada placa de tratamiento se realizó sobre tres réplicas. Se preparó una placa tratada con fungicida comercial Mancozeb en su dosis comercial recomendada (16 mg/mL)113 y una placa sin ningún tratamiento para comparación entre todos los tratamientos. Las placas se incubaron a 28 \(^\circ\)C durante 7 días. El crecimiento radial de la colonia de hongos se controló diariamente hasta que la colonia de más rápido crecimiento cubrió el diámetro total de la placa. La inhibición del crecimiento fúngico se calculó utilizando la siguiente fórmula y se expresó como porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PIRG)38:

La actividad de los CNP y NiCNC sobre la inhibición de la germinación de esporas se evaluó mediante el método de deslizamiento concavitario. La suspensión de conidias se preparó vertiendo 10 ml de agua destilada estéril en los tubos de cultivo esporulados de 7 días y agitando suavemente, seguido de filtrar la suspensión con una gasa. Luego, se mezclaron 150 µL de suspensión de conidias con un volumen igual de CNP y NiCNC en diferentes concentraciones como las utilizadas en el experimento anterior. También se preparó una configuración similar con 16 mg/ml de Mancozeb. Se colocaron en el portaobjetos aproximadamente 60 µl del híbrido que contenía aproximadamente 1,0 × 106 conidios/ml y se incubaron durante 6 h a 28 \(^\circ\)C en una cámara húmeda. Después de 6 h, los conidios se examinaron al microscopio óptico (Magnus, ch-20i, Olympus). El número total de esporas germinadas se contó a partir del total de esporas presentes en seis áreas del portaobjetos elegidas al azar bajo el microscopio. El % de inhibición de la germinación de las esporas se calculó utilizando la siguiente fórmula112:

El efecto de los CNP y NiCNC sobre la supresión de la esporulación se examinó utilizando un medio inductor de esporulación apropiado, es decir, medio Czapek Dox Agar, mezclado con soluciones de CNP y NiCNC para obtener una concentración final de 0,001, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 mg/ml. Las concentraciones se compararon con un blanco y Mancozeb. Después de la esterilización completa, se vertieron 4 ml del híbrido en la placa de Petri y se dejaron enfriar. Luego, se transfirió asépticamente un inóculo fúngico de aproximadamente 0,5 cm de diámetro al medio tratado. Las placas se incubaron durante 72 h a 28 \(^\circ\)C. La densidad de esporas para cada tratamiento se midió utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio óptico71.

Para la estimación cuantitativa de esporas viables se realizó un ensayo colorimétrico utilizando XTT hidróxido de 2,3-Bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenil-amino)carbonil]-2H-tetrazolio. (TC239, Himedia, India). Este ensayo también involucra un agente de acoplamiento de electrones Menadiona (CAS No. 58-27-5, Sigma Aldrich, EE. UU.). Brevemente, se preparó una suspensión de esporas (1,0 × 106 conidios/ml) en medio líquido Czapeck y se cultivaron 100 µl de la suspensión en una microplaca de fondo plano de 96 pocillos durante 4 h a 28 \(^\circ\)C. Después de la incubación, se agregaron a la suspensión 100 µL de ambas nanopartículas en diferentes rangos de concentraciones (0,001, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 mg/mL) y se incubaron nuevamente durante otras 4 h a la misma temperatura. Se añadieron a la suspensión 50 µl de solución de XTT a una concentración de 400 µg junto con 7 µl de menadiona (25 µM). Las microplacas se incubaron durante 3 h a 28 \(^\circ\)C y se midió la densidad óptica a 450 nm114.

El efecto de las concentraciones antes mencionadas de CNP y NiCNC sobre la peroxidación lipídica de los hongos se determinó mediante la estimación cuantitativa del malondialdehído (MDA), un indicador de la peroxidación lipídica. La capa micelial tratada con nanopartículas se recogió después de 7 días de incubación a 28 \(^\circ\)C. La estera micelial se lavó minuciosamente con agua destilada estéril y luego se secó con papel secante. Se homogeneizaron en frío 2 g de micelio con 10 ml de tampón de fosfato sódico 0,1 M (pH 7,0) en un mortero previamente enfriado. Este homogeneizado se centrifugó en frío a 10.000 rpm durante 12 min. El sobrenadante libre de células se utilizó para la estimación de MDA. Se mezclaron 100 µl del homogeneizado con 3 ml de solución de ácido tiobarbitúrico al 0,335 % (p/v) (Himedia, India) que contenía ácido tricloroacético al 10 % (p/v) (Himedia, India). La mezcla se sometió a un baño de agua hirviendo durante 15 min. El nivel de MDA se determinó en el espectrofotómetro 169 (Systronics) y se calculó con un coeficiente de absorción molar de 1,56 × 105 a 530 nm115.

El ensayo de estrés oxidativo se llevó a cabo para detectar el nivel de ROS producido en las hifas de los hongos como efecto del tratamiento con CNP y NiCNC. En este experimento se utilizó una molécula sonda típica, no polar y no fluorescente, permeable a las células, diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFH-DA) (D6665; Sigma Aldrich, EE. UU.). Esta molécula hidrófoba, cuando ingresa al interior de la célula, se desacetila en 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH) por las esterasas intracelulares. El DCFH se oxida por las ROS producidas en la célula como resultado de la generación de estrés debido a la exposición a nanopartículas. DCFH se convierte en diclorofluoresceína (DCF), que proporciona una fluorescencia verde detectable al excitarse. Las hifas del hongo se cultivaron en caldo de papa dextrosa (PDB) que contenía CNP y tratamiento con NiCNC a 0,04 mg/ml y 16 mg/ml de Mancozeb durante 72 h a 28 \(^\circ\)C. Después de 72 h, las hifas se recogieron mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min. Se descartó el medio con el sobrenadante. Las células de hifas se lavaron tres veces con solución salina tampón fosfato (PBS) y las hifas se mantuvieron suspendidas en la misma. La suspensión de hifas se mezcló con 40 µL de H2DCFH-DA en una cámara oscura. Los tratamientos se incubaron durante 2 h en la oscuridad a 28 \(^\circ\)C con agitación periódica. Finalmente, la generación de ROS se observó visualmente bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse E200, Nikon, Tokio, Japón) con filtro de excitación a 485 nm y filtro de emisión a 525 nm71.

Los cambios morfológicos en las esporas del hongo como resultado del tratamiento con CNP y NiCNC a 0,04 mg/ml y Mancozeb a 16 mg/ml se observaron bajo microscopio electrónico de barrido (SEM) (JSM-IT 100; JEOL). Las esporas de hongos en el PDB se trataron con nanopartículas y se incubaron durante 72 h. Los conidios fúngicos fueron sometidos a un tratamiento previo antes del examen microscópico116.

Se realizó una prueba para evaluar la capacidad de los CNP y NiCNC para reducir la incidencia de la pudrición. Para el experimento se utilizó un cultivar de trigo harinero (Triticum aestivum L.) (PBW 343) recolectado de National Seed Corporation of India Ltd.. Todos los experimentos con plantas cumplieron con las directrices y la legislación institucionales, nacionales e internacionales pertinentes. El F. solani aislado se utilizó como inóculo para la inoculación artificial en las plántulas para obtener síntomas de pudrición del tallo y del pie en plántulas en desarrollo. La concentración del inóculo fue de 106 conidios/mL. La inoculación artificial del patógeno se realizó mediante el método de irradiación de raíces. Brevemente, se vertieron 5 ml de suspensión de conidias alrededor de la base del tallo de plántulas de 4 días. Después de 24 h de inoculación, se aplicó el mismo volumen de 0,04 mg/ml de CNP y NiCNC siguiendo el mismo procedimiento anterior. Las plántulas se cultivaron en bandejas de plástico (14 × 30 × 7 cm) que contenían 5 kg de tierra mezclada con vermiculita en una proporción 1:1. Los tratamientos se clasificaron de la siguiente manera: plántulas no tratadas, tratadas con CNP (0,04 mg/mL), NiCNC (0,04 mg/mL) y Mancozeb (16 mg/mL). Cada tratamiento se dividió nuevamente en conjuntos inoculados y no inoculados con F. solani. Para cada conjunto se sembraron 30 plántulas a igual distancia en las bandejas. El experimento se programó para 20 días y se realizó riego regular. Después de completar los 20 días, se registraron los síntomas de pudrición causada por F. solani para cada planta con base en una escala de 5 niveles sugerida por Santori e Infantino (2009)117: 0 = síntomas ausentes; 1 = ligera coloración marrón oscuro en la raíz o base del pie; 2 = coloración marrón oscuro en casi la mitad del tallo o raíz; 3 = tallo o raíz totalmente marrón oscuro; 4 = muerte de toda la planta. Los datos recopilados se colocaron en la fórmula de McKinney (1923) para la evaluación del índice de enfermedad118.

donde Fk = número de plántulas infectadas en la parcela de tratamiento (según escala de 5 niveles); n es igual al número total de plántulas evaluadas (n = 30); xk es igual al número total de plántulas infectadas del conjunto de control.

A partir del experimento también se evaluó la incidencia de enfermedades de las plántulas119.

El vigor morfológico de las plántulas tratadas se analizó utilizando la siguiente fórmula de índice de vigor120

Se calcularon los índices de estrés de las plántulas tratadas para evaluar el efecto del tratamiento con CNP y NiCNC en la mitigación del estrés patógeno sobre el vigor de las plántulas121.

La línea celular de riñón humano (ACHN) se adquirió del Centro Nacional de Ciencia Celular (NCCS), Pune, India. La citotoxicidad se examinó utilizando el ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio)122,123. Se sembró una línea celular de riñón humano de rápida proliferación en una placa de microtitulación de 96 pocillos a 37 °C, en presencia de 5% de CO2 en medio de cultivo de células Ham F-12 DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) a una densidad de 6 x 103 células/ Bueno. Después de 24 h, cuando las células alcanzaron una confluencia significativa, se agregaron nanopartículas de CNP y NiCNC en cada pocillo en diferentes concentraciones que oscilaban entre 0,01 y 0,4 mg/ml por triplicado. Las placas tratadas se incubaron adicionalmente en las mismas condiciones durante 24 h. Al día siguiente, se retiraron las placas de la incubadora y se aspiró el medio de cultivo celular. Se agregaron 10 µl de MTT disueltos en 1X PBS en cada pocillo y la placa se mantuvo nuevamente durante 3 h en las condiciones mencionadas anteriormente. Finalmente, se agregaron 50 µl de isopropanol a cada pocillo que contenía solución de MTT y se agitó durante aproximadamente 10 minutos. La absorbancia se registró a 620 nm en un lector de ELISA.

El porcentaje de toxicidad celular se calculó como [(C−T)/C × 100], donde "C" es la densidad óptica media del control (células no tratadas) y "T" es la densidad óptica media de las células tratadas con diferentes concentraciones. de nanopartículas.

Todos los datos obtenidos de los experimentos realizados se representaron como la media de seis observaciones diferentes con desviación estándar (DE) (Media ± DE). Las diferencias estadísticas se analizaron mediante el uso de la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan (DMRT) a p ≤ 0.05 (DSAASTAT ver. 1.022), donde los tratamientos que difieren significativamente se denotaron con las letras a, b, c, etc. Análisis estadístico de los parámetros de germinación entre inoculados y las plántulas no inoculadas se realizaron utilizando la prueba t de dos colas no apareadas para encontrar la diferencia significativa entre los diferentes tratamientos utilizando el software GraphPad Prism ver. 6 para Windows (GraphPad Software, Inc. EE. UU.) en p < 0,05.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Los autores desean agradecer a la Comisión de Becas Universitarias (Gobierno de la India) por brindar apoyo a la investigación básica, ya que el primer autor recibe la beca UGC-NET JRF. Los autores también agradecen a National Seeds Corp. Ltd., SAIF-IIT Bombay, CIF-LPU (India) y al Departamento de Zoología (Universidad de Bengala del Norte, India) por su cooperación.

Palash Mandal ha fallecido.

Laboratorio de Nanobiología y Fitoterapia, Departamento de Botánica, Universidad de Bengala del Norte, Darjeeling, WB, 734013, India

Divya Chouhan y Palash Mandal

Laboratorio ANMOL, Departamento de Biotecnología, Universidad de Bengala del Norte, Darjeeling, WB, 734013, India

Ankita Dutta y Anoop Kumar

Departamento de Botánica, St. Xavier's College de Bengala del Norte, Jalpaiguri, WB, 735134, India

Chandrani Choudhury

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DC: Metodología, Validación, Análisis formal, Curación de datos, Redacción: borrador original, Visualización. AD—Análisis de citotoxicidad: Metodología y validación. AK—Análisis de citotoxicidad: conceptualización y supervisión. PM—Conceptualización, Supervisión, Administrador de proyectos, Redacción-edición. CM—Conceptualización, Supervisión, Administrador de proyectos. Las figuras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9 fueron preparadas por DC, excepto la figura 8, que fue preparada por AD. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Chandrani Choudhury.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Chouhan, D., Dutta, A., Kumar, A. et al. Aplicación del nanoconjugado de níquel-quitosano como agente antifúngico para combatir la pudrición por Fusarium del trigo. Informe científico 12, 14518 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18670-2

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Recibido: 23 de marzo de 2022

Aceptado: 17 de agosto de 2022

Publicado: 25 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18670-2

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