Evaluación de la diversidad genética y el desarrollo de marcadores SNP en germoplasma de maní en Taiwán por RAD

Jul 09, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 14495 (2022) Citar este artículo

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El maní cultivado (Arachis hipogaea L.) es un cultivo oleaginoso importante, pero tiene una diversidad genética limitada. Los marcadores moleculares se pueden utilizar para investigar la diversidad genética de diversos germoplasmas. En este estudio, se utilizó el método de ADN asociado al sitio de restricción (RAD) para secuenciar 31 accesiones de germoplasma de maní taiwanés, lo que llevó a la identificación de un total de 17 610 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Cuando agrupamos estas 31 muestras en dos subconjuntos según su origen, encontramos que el subconjunto "global" (n = 17) era más diverso genéticamente que el subconjunto "local" (n = 14). En cuanto a las variedades botánicas, la var. El subconjunto fastigiata tenía mayor diversidad genética que los otros dos subconjuntos de var. vulgaris y var. hipogaea, lo que sugiere que se deberían introducir nuevos recursos genéticos en los programas de mejoramiento para mejorar la diversidad genética. El análisis de componentes principales (PCA) de los datos de genotipado separó las 31 muestras en tres grupos en gran medida según las variedades botánicas, lo que coincide con el resultado del PCA para 282 muestras genotipadas mediante 14 marcadores de PCR competitivos alelos específicos (KASP) desarrollados en este estudio. Los marcadores SNP identificados en este trabajo no solo revelaron la relación genética y la estructura poblacional del germoplasma actual en Taiwán, sino que también ofrecen una herramienta eficiente para el mejoramiento y otras aplicaciones genéticas.

Originario de América del Sur, el maní cultivado (Arachis hipogaea L.) es un alotetraploide (AABB, 2n = 4x = 40) y una leguminosa importante a nivel mundial. Los seres humanos se benefician de las semillas de maní como alimento y fuente de aceite debido a su alto porcentaje de proteínas y ácidos grasos1. La producción anual de maní ha aumentado en los últimos 20 años hasta alcanzar 53 millones de toneladas en 2020 según FAOSTAT (http://www.fao.org/faostat). Para satisfacer la creciente demanda de maní bajo la amenaza del cambio climático, el cultivo de nuevas variedades es una estrategia eficaz para mejorar las características cualitativas y cuantitativas del maní.

La conservación del germoplasma de Arachis y la explotación de su diversidad genética son cruciales para el mejoramiento del maní cultivado. Actualmente, varios bancos de genes son reconocidos por su germoplasma de Arachis, incluido el Instituto Internacional de Investigación de Cultivos para las Zonas Tropicales Semiáridas (ICRISAT), el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y el Instituto de Investigación de Cultivos Oleaginosos de la Academia China de Ciencias Agrícolas ( OCRI-CAAS). Se recolectaron más de 15.000, 9.000 y 8.000 muestras en ICRISAT, USDA y OCRI-CAAS2, respectivamente. Por otro lado, comprender la diversidad genética del germoplasma disponible es un requisito previo antes de lanzar programas de mejoramiento, y la utilización de marcadores moleculares es la estrategia predominante para evaluar la diversidad genética del germoplasma en la actualidad3. El maní cultivado tiene su baja diversidad genética debido a la reciente hibridación de sus dos ancestros y la selección en programas de mejoramiento4,5,6,7. Aunque la estrecha diversidad genética del maní cultivado ha obstaculizado el desarrollo de marcadores moleculares, ha sido posible desarrollar y utilizar marcadores de repetición de secuencia simple (SSR) para evaluar la diversidad genética en el maní cultivado8,9,10,11. En particular, los marcadores SSR revelaron las estructuras poblacionales de 92 muestras de la Peanut Mini Core Collection de EE. UU. y 196 cultivares importantes de maní en China. Aunque los marcadores SSR se utilizaron ampliamente para identificar la diversidad genética de las poblaciones de maní, estos estudios tuvieron un tamaño de población limitado debido al desafiante proceso de genotipificación.

Recientemente, los proyectos del genoma del maní posibilitados por la secuenciación de próxima generación (NGS) han revolucionado la investigación genética en maní cultivado. Hasta el momento, se han secuenciado los genomas de Arachis hipogaea L. y sus dos ancestros diploides, A. duranensis (AA) y A. ipaensis (BB)6,7,14. Estas secuencias genómicas de alta calidad han allanado el camino para el desarrollo de marcadores de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de alto rendimiento, por ejemplo mediante genotipado por secuenciación (GBS), que luego pueden facilitar el mejoramiento molecular del maní. La matriz de 58 K SNP 'Axiom_Arachis', desarrollada mediante la resecuenciación de 41 muestras de maní, se utilizó para identificar la diversidad genética en 384 genotipos de Arachis, incluida la Mini Core Collection del USDA y especies silvestres15,16, mientras que 787 muestras de la colección principal de Peanut de EE. UU. fueron genotipadas por el Matriz de SNP de 14 K 'Arachis_Axiom2' para revelar su diversidad genética17. En comparación con las matrices de SNP, GBS es una técnica más rentable basada en la secuenciación del genoma reducido asociado con sitios de restricción utilizando NGS18,19. En la investigación del maní, esta técnica se aplicó en el desarrollo de SNP, permitiendo la construcción de mapas genéticos para el mapeo de locus de rasgos cuantitativos (QTL) y el análisis de la estructura poblacional20,21,22.

En Taiwán, los programas de mejoramiento del maní se remontan a finales de los años cincuenta. Hasta la fecha, la mayoría de las variedades desarrolladas localmente se han obtenido mediante mejoramiento convencional basado en la evaluación de rasgos morfológicos. En tales programas de reproducción, la selección de los padres se basó principalmente en la información del pedigrí o la fuente de colección para inferir relaciones genéticas. Por lo tanto, explotar las herramientas moleculares disponibles para caracterizar las variedades actuales de maní en Taiwán debería permitir mejorar los programas de mejoramiento en el futuro. En este estudio, realizamos el enfoque de ADN asociado al sitio de restricción (RAD) para secuenciar 31 genotipos, incluidas variedades de élite actuales desarrolladas en Taiwán e importantes muestras introducidas desde el extranjero, para revelar la diversidad genética subyacente. Además, se diseñaron 14 marcadores de PCR competitivos específicos de alelo (KASP) que luego se utilizaron para genotipar otras 282 muestras. En general, este trabajo revela la estructura genética del germoplasma de maní en Taiwán a través de marcadores SNP identificados por RAD-seq y estos marcadores pueden usarse para una serie de aplicaciones, como la identificación de variedades y programas de mejoramiento.

Se eligieron 31 muestras de maní, mantenidas por el Instituto de Investigación Agrícola de Taiwán (TARI) y la Estación de Extensión e Investigación Agrícola del Distrito de Tainan (Tainan DARES), para la construcción de RAD-seq. Estas muestras consisten en cultivares de élite, líneas de mejoramiento avanzadas y muestras antiguas "introducidas" adquiridas en países sudamericanos cercanos al origen geográfico del maní (Tabla complementaria S1). Entre las 31 muestras de maní, hay 13 muestras de tipo español, 11 de Valencia, 3 de Virginia y 4 de tipo Runner. Para el genotipado mediante marcadores KASP, se obtuvieron 282 accesiones de maní del Centro Nacional de Recursos Fitogenéticos en TARI, incluidas 66 accesiones españolas, 27 valencianas, 49 virginianas y 88 de tipo Runner. Los materiales vegetales utilizados en este estudio se ajustan a las directrices internacionales, nacionales e institucionales pertinentes.

La extracción de ADN de todas las accesiones se basó en hojas jóvenes recolectadas de plántulas en un plazo de dos semanas utilizando el método CTAB modificado que reemplaza el fenol y el cloroformo con acetato de potasio para eliminar proteínas y polisacáridos23. Las muestras de ADN extraídas del método CTAB modificado se pueden utilizar directamente para el genotipado de KASP, pero necesitan una purificación adicional para garantizar su calidad para la construcción de la biblioteca RAD-seq. Así, después de extraer el ADN de 31 muestras utilizadas para RAD-seq, utilizamos el kit QIAGEN (DNeasy Blood & Tissue Kit; Qiagen, https://www.qiagen.com/, Hilden, Alemania) para purificar estas muestras de ADN que fueron luego se cuantificó y calificó mediante el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., https://www.thermofisher.com, DE, EE. UU.). Las muestras de ADN purificadas con (1) la proporción 260/280 de 1,8 a 2,0, (2) la proporción 260/230 de 2,0 a 2,4 y (3) la concentración ≥ 25 ng/μl se verificaron adicionalmente para determinar la integridad del ADN mediante Electroforesis en gel de agarosa (1,0%).

24 de las 31 accesiones de maní utilizadas en RAD-seq y 282 accesiones de maní adicionales del germoplasma se fenotiparon en el otoño de 2016 en TARI (coordenadas 24° 01′ 47.5″ N 120° 41′ 47.4″ E), y 20 plantas de cada accesión se evaluaron ocho rasgos cuantitativos, incluidos los días hasta la floración (entre la fecha de siembra y la floración), arquitectura de la planta, número de vainas, rendimiento (g/m2), peso de 100 vainas, peso de 100 semillas, resistencia a la roya y Resistencia a las manchas foliares. La susceptibilidad a estas dos enfermedades del maní se cuantificó en condiciones naturales en el campo, ya que estas enfermedades se desarrollan espontáneamente durante el otoño, y los síntomas de la enfermedad se calificaron de 1 (sin síntomas) a 9 (altamente susceptible)24. Dependiendo del grado de inclinación respecto de la verticalidad, la arquitectura vegetal se puntuó desde 0 (la más erguida) hasta 9 (la más postrada).

Después de finalizar la extracción de ADN, la purificación y el control de calidad de 31 muestras de maní, utilizamos 1,1 µg de cada muestra de ADN de alta calidad para crear dos bibliotecas RAD-seq de 16 y 15 muestras, respectivamente, siguiendo el protocolo publicado, y se eligió PstI como la enzima de digestión25. La secuenciación de próxima generación de cada biblioteca se llevó a cabo en el Centro de Investigación del Genoma de la Universidad Yang-Ming utilizando la plataforma Illumina Hiseq 2500 (Illumina Inc., https://www.illumina.com, CA, EE. UU.) con secuenciación única de 100 pb. El final se lee en dos carriles. Los datos de secuenciación se han depositado en el Centro Nacional de Información Biotecnológica NCBI bajo el BioProyecto PRJNA811600. Para las llamadas SNP, Stacks primero descodificaba las lecturas de un solo extremo utilizando el programa “process_radtags”26. Luego, utilizamos Burrows-Wheeler Alignment (BWA) v0.7.17-r1188 “aln” para alinear las lecturas de cada accesión con el genoma de referencia del maní cultivado y sus ancestros diploides para identificar los SNP utilizados en el análisis de diversidad genética y el desarrollo de Marcadores KASP, respectivamente6,14,27. Cuando se publicó el genoma del maní cultivado14, todos los marcadores KASP utilizados en este estudio ya habían sido diseñados utilizando los genomas fusionados de dos ancestros diploides del maní cultivado6. Por lo tanto, los SNP identificados basados ​​en el genoma del maní cultivado solo se utilizaron para los análisis in-silico que investigaron la diversidad genética de las 31 muestras, pero en todos los casos el proceso de llamada de SNP fue el mismo. Una vez finalizada la alineación, se utilizaron Samtools y BCFtools para llamar y filtrar SNP, los SNP se mantuvieron con (1) calidad base ≥ 20, (2) puntuación de calidad de mapeo ≥ 20 y (3) profundidad ≥ 3. Luego, se realizó un análisis personalizado. Se utilizó el script R para crear archivos de formato de llamada variante (VCF) que abarcan SNP calificados que discriminaron las 31 muestras28.

Entre los SNP disponibles para distinguir 31 muestras de maní según el genoma de los dos ancestros diploides6, extrajimos 1230 SNP homocigotos con alelos informativos en las 31 muestras y luego descartamos 783 SNP que tenían valores de contenido de información polimórfica (PIC) inferiores al promedio de todas las muestras. SNP. Finalmente, se seleccionaron 29 de 477 SNP con un valor PIC promedio de 0,28 para desarrollar marcadores KASP. Estos 29 SNP putativos con secuencias flanqueantes de 100 pb en ambos lados se utilizaron para diseñar cebadores KASP que luego se sintetizaron mediante genómica LGC (//www.lgcgroup.com, Teddington, Inglaterra). La validación de los marcadores KASP se realizó en el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus™ de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific Inc., https://www.thermofisher.com, DE, EE. UU.), y cada reacción de 10 μl constaba de 12,5 ng de ADN, 0,14 μL de mezcla de ensayo KASP y 5 μL de KASP Master Mix (2X). El protocolo de PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: (1) etapa de prelectura a 30 °C durante 1 min, (2) etapa de retención a 94 °C durante 15 min, (3) etapa de PCR 1 de 10 ciclos de touchdown usando 94 ° C durante 20 s y 61 °C (disminuyendo 0,6 °C por ciclo) durante 1 min, (4) PCR etapa 2 con 26 ciclos de amplificación a 94 °C durante 20 s y 55 °C durante 1 min, y (5) post -leer la etapa a 30 °C durante 1 min. Cuando se completaron las PCR, el software StepOne ™ analizó las señales fluorescentes de las muestras para determinar los genotipos.

Todos los análisis estadísticos se realizaron en R 3.63. Para cada marcador SNP se determinó el valor de PIC y la heterocigosidad esperada (He)29,30. El análisis de componentes principales (PCA) utilizando datos fenotípicos se realizó mediante la función "PCA" en el paquete "FactoMineR"31. En el paquete “poppr”, se utilizó la función “bitwise.dist” para calcular las distancias genéticas entre las 31 accesiones, y estas distancias se calcularon dependiendo de la fracción de loci que difieren entre el germoplasma32,33. La función "aboot" se utilizó para construir los dendrogramas basados ​​en el método de grupos de pares no ponderados con media aritmética (UPGMA) con 1000 bootstraps. En el paquete “adegenet”, el PCA para los datos de SNP de 31 muestras se llevó a cabo mediante la función “glPCA”, y la estructura poblacional de 282 muestras se abordó mediante agrupamiento sucesivo de K-media y análisis discriminante de componentes principales (DAPC) utilizando el “ find.clusters” y función “dapc”, respectivamente34,35. Además del gráfico de dendrograma, creado por la función "plot.phylo" en el paquete "ape"36, toda la visualización se realizó utilizando la función "ggplot" en el paquete "tidyverse"37.

En este estudio, se eligieron 31 muestras de maní para realizar RAD-seq, de las cuales 17 muestras se introdujeron desde el extranjero y 14 muestras se desarrollaron o recolectaron en Taiwán. Esta colección tiene rasgos agronómicos importantes que incluyen rasgos relacionados con el rendimiento, resistencias al estrés biótico y abiótico y características valiosas a nivel de diversidad genética (Tabla complementaria S1).

En el enfoque RAD-seq, se utilizó la enzima de seis cortadores, PstI, para la digestión del ADN, por lo que la secuenciación de cada acceso se centró en aproximadamente el 5 % (extensiones de 100 pb en ambos lados de un sitio de corte de PstI que ocurre cada 4.096 pb en promedio) del genoma total del maní cultivado (2,7 Gb). La profundidad de secuenciación estimada en las 31 accesiones osciló entre 4,26 (HL2) y 15,01 (Rojo), y la profundidad promedio fue 9,47. Además, más del 99,0 % de las lecturas secuenciadas de todas las muestras se alinearon correctamente con el genoma de referencia. En comparación con el genoma de referencia, A. hipogaea cv. Tifrunner, se identificaron entre 1475 y 14 471 SNP de estas 31 muestras con un promedio de 5249 SNP, y más de 3 cuartas partes de estos polimorfismos eran homocigotos. Además, la relación transición/transversión (Ts/Tv) osciló entre 0,48 y 1,19 (Tabla 1). En cuanto a las tres variedades botánicas del maní cultivado, las accesiones de la subsp. fastigiata var. vulgaris (tipo español), subsp. fastigiata var. fastigiata (tipo Valencia) y subsp. hipogea var. hipogaea (tipos Virginia/Runner) tenía un total de 5006, 5119 y 5905 SNP, es decir, las diferencias entre las variedades botánicas fueron muy pequeñas. Curiosamente, las 31 muestras se separaron bien según la colección global y local, correspondientes a 17 genotipos introducidos desde otros países y 14 genotipos de Taiwán, respectivamente. La colección global tuvo un promedio de 6071 SNP, que fue superior al promedio de 4526 SNP de la colección local. Además, 8 muestras introducidas, recolectadas en América del Sur cerca del centro de origen del maní cultivado, dieron como resultado un promedio de 7139 SNP, incluso mayor que el de la colección global. Este resultado sugirió que el germoplasma de la colección global de varios países tenía más polimorfismos que el local que contenía principalmente cultivares taiwaneses.

Luego, se realizó la siguiente etapa de filtración para mantener solo los SNP que diferenciaban estas 31 accesiones. Como resultado, finalmente se conservaron 3.474 de 17.610 SNP para el análisis de diversidad genética utilizando una tolerancia de 6 valores faltantes (20%) como máximo para cada polimorfismo.

La diversidad genética de las 31 muestras de maní se cuantificó mediante una serie de medidas, incluida la heterocigosidad esperada (He), la frecuencia del alelo principal (MAF), el contenido de información polimórfica (PIC) y la distancia genética. La distancia genética se basó en la distancia bit a bit, idéntica a la distancia de Provesti, creciendo con la fracción de loci genéticamente diferentes entre 31 accesiones32. La comparación por pares de la distancia genética entre las muestras se incluye en la Tabla complementaria S2. En promedio, estas 31 muestras de maní tenían un He de 0,19, un PIC de 0,16, un MAF de 0,87 y una distancia de 0,17. Al considerar las variedades botánicas, el germoplasma de la subsp. fastigiata var. fastigiata tuvo el mayor promedio de He, PIC y distancia genética (He = 0,18, PIC = 0,15, distancia = 0,15) y el MAF más pequeño (0,87), en comparación con el germoplasma de la subsp. fastigiata var. vulgaris (He = 0,13, PIC = 0,11, MAF = 0,90, distancia = 0,11) o subsp. hipogea var. hipogaea (He = 0.12, PIC = 0.10, MAF = 0.92, distancia = 0.11) (Tabla 2), lo que muestra que el germoplasma tipo Valencia adquirió una mayor diversidad genética que el germoplasma tipo español y el tipo Virginia/Runner. En términos de la fuente de recolección, la colección global tuvo un promedio de He, PIC y distancia genética mayor (He = 0,19, PIC = 0,15, distancia = 0,17) y un MAF más pequeño (0,86) que la colección local (He = 0,16, PIC = 0,14). , MAF = 0,88, distancia = 0,14), lo que indica que la colección global tenía una mayor diversidad genética que la colección local. Además, se reconstruyó el árbol de distancias para el análisis de conglomerados con base en el método UPGMA con 1000 bootstraps (Fig. 1). Los resultados mostraron que 26 de las 31 muestras se agruparon en 3 grupos principalmente según tres variedades botánicas. Germoplasma de subsp. fastigiata var. fastigiata y subsp. fastigiata var. vulgaris se agruparon en los Grupos I y II con una distancia de 0,19, y el germoplasma de la subsp. hipogea var. hipogaea se agrupó en el Grupo III separado del Grupo I y II con una distancia de 0,21. Con excepción de 5 accesiones, NS011001 (tipo Virginia) se agrupó en el grupo I con germoplasma principalmente de tipo Valencia, mientras que dos accesiones de tipo Valencia, Red y HL2, se agruparon en el grupo II con germoplasma de tipo mayoritariamente español. Curiosamente, TN16 y TN17, dos cultivares tipo Valencia, se agruparon en el grupo III, pero se separaron de las accesiones de la subsp. hipogea var. hipogea con una distancia de 0,18.

Dendrograma de las 31 accesiones creadas a partir del método de grupos de pares no ponderados con media aritmética (UPGMA). Este dendrograma se basó en la distancia genética por pares con 1000 réplicas utilizando 3474 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). La longitud de la rama representa la distancia genética y la escala se encuentra en la parte superior izquierda de esta figura. Los números en las ramas son porcentajes de arranque. La leyenda muestra el color de cuatro tipos de mercado, español (SP), Valencia (VA), Virginia (VR), Runner (RN), y tres clados agrupados en este gráfico fueron nombrados I, II y III.

Para investigar más a fondo y comparar la relación genética entre estos germoplasmas, se realizó PCA utilizando distancias genéticas entre las 31 muestras calculadas mediante 3474 SNP. El resultado de PCA mostró que los primeros tres componentes principales (PC1, PC2 y PC3) explicaron el 24,2%, el 20,8% y el 8,2% de la varianza, respectivamente, totalizando el 53,2% de la varianza genética general de la distancia (Fig. 2). Sin embargo, los diagramas de dispersión de las PC sugirieron que la PCA basada en datos genómicos distinguía bien las 31 muestras. En los tres biplots de PC1/PC2, PC2/PC3 y PC1/PC3 basados ​​en PCA utilizando 3474 SNP, el primer par logró distinguir 31 muestras en tres grupos claros, principalmente según tres variedades botánicas, subsp. fastigiata var. vulgaris (tipo español), subsp. fastigiata var. fastigiata (tipo Valencia) y subsp. hipogea var. hipogaea (tipos Virginia/Runner), mientras que el segundo y tercer par fueron capaces de separar TN16 y TN17 de tres grupos asignados por el primer par (Fig. 2). Además, el diagrama de dispersión 3D creado con las tres PC mostró una relación de 31 accesiones compatibles con los tres biplots de PC (Fig. 2).

Análisis de componentes principales (PCA) de las 31 muestras basado en 3474 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Las 31 adquisiciones fueron visualizadas por 4 tipos de mercado, español (SP), Valencia (VA), Virginia (VR), Runner (RN).

En este estudio, uno de nuestros objetivos fue diseñar un conjunto de marcadores SNP no basados ​​en gel que pudieran explotarse para investigar la estructura genética dentro de la colección de germoplasma conservada en el Centro Nacional de Recursos Fitogenéticos de TARI. Cuando se lanzó este proyecto, el genoma del maní cultivado aún no estaba publicado. Por lo tanto, el desarrollo de marcadores SNP para el genotipado KASP se basó en los dos ancestros diploides del maní cultivado6. Tenga en cuenta que el canal de llamadas de SNP utilizado aquí fue el mismo que identificó los SNP del genoma del maní cultivado para evaluar la diversidad genética de las 31 muestras. De los SNP identificados mediante el mapeo de los dos genomas ancestrales diploides, 1230 tenían ambos alelos representados en las 31 accesiones, al tiempo que cumplían la restricción de ser homocigotos y no faltar datos en ellos. 477 de estos SNP se mantuvieron porque su valor PIC era mayor que el promedio de los 1230 SNP homocigotos (Tabla complementaria S3). Al mismo tiempo, realizamos un experimento de campo en el otoño de 2016 para evaluar 8 rasgos agronómicamente cuantitativos para 24 de las 31 muestras utilizadas en RAD-seq y las otras 282 muestras de maní del germoplasma TARI con 66 españolas, 27 valencianas, 49 Virginia y 88 accesiones tipo Runner. Las estadísticas resumidas indicaron que las accesiones de la subsp. fastigiata tenía características de madurez temprana, más vainas y mayor rendimiento, pero ligeramente menos resistencia a las manchas en comparación con las accesiones de la subsp. hipogea (Tabla complementaria S4). Los datos fenotípicos de este ensayo nos permitieron comparar la capacidad de los datos genotípicos y fenotípicos para identificar relaciones genéticas entre las muestras de maní (Tabla complementaria S5).

Realizamos PCA por separado para los datos genotípicos de 29 de 477 SNP con un valor PIC promedio de 0,28 y para los datos fenotípicos (8 rasgos agronómicos de 24 de las 31 muestras basadas en experimentos de campo). Para el PCA basado en 29 SNP, se agruparon 31 muestras en tres grupos según sus variedades botánicas (Fig. 3). Además, con valores propios entre 0,49 y 1,79, las tres primeras PC representaron el 67,8% de la varianza total (Tabla complementaria S6). Los tres marcadores SNP principales que tuvieron la mayor contribución a tres PC fueron los siguientes: (1) PC1: B02_105774702, B04_1643180, B09_70140267 y B09_141920571, (2) PC2: A01_9265671, A02_65802170 y A01_90269752 y (3) PC3: B05_133797191, A09_45155599 y A01_90916564 (Tabla complementaria S6). Por otro lado, PC1, PC2 y PC3 en el PCA que se basó en los datos fenotípicos de 8 rasgos agronómicos acumularon el 73,0% de la varianza fenotípica general, y estos PC tenían valores propios que oscilaban entre 1,46 y 2,41 (Tabla complementaria S7). Los tres rasgos principales que más contribuyeron a tres PC fueron los siguientes: (1) PC1: rendimiento, número de vainas y días para florecer, (2) PC2: arquitectura de la planta, número de vainas y peso de 100 semillas y (3) PC3: nivel de mancha foliar, nivel de óxido y peso de 100 vainas (Tabla complementaria S7). A diferencia del resultado de PCA que utilizó 29 SNP, para los tres biplots y el diagrama de dispersión 3D del PCA dependiendo de los datos fenotípicos, ninguno proporcionó mucha evidencia de la estructura dentro de las 24 de las 31 muestras (Figura complementaria S1), lo que sugiere que 29 SNP pudieron distinguir mejor 31 accesiones que 8 rasgos agronómicos. Por tanto, estos 29 SNP se diseñaron como marcadores KASP.

Análisis de componentes principales (PCA) de las 31 muestras basado en 29 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Se visualizaron 31 adhesiones por 4 tipos de mercado, español (SP), Valencia (VA), Virginia (VR), Runner (RN).

Para validar estos 29 marcadores KASP se genotiparon 282 accesiones del germoplasma TARI con 66 accesiones españolas, 27 valencianas, 49 virginianas y 88 del tipo Runner. 14 de 29 marcadores KASP mostraron un resultado de genotipado estable y discernible en el proceso de validación inicial. Luego, PCA determinó el análisis de la estructura de la población de 282 muestras utilizando distancias genéticas entre estas 282 muestras calculadas mediante los datos de genotipado del marcador KASP (Tabla complementaria S8) o los datos fenotípicos del experimento de campo en el otoño de 2016 basado en 8 análisis agronómicos. rasgos. Los biplots de PCA indicaron que el PCA que utilizó los datos genotípicos tuvo un mejor desempeño que el que utilizó los datos fenotípicos para distinguir 282 muestras. Para los diagramas de dispersión basados ​​en datos genómicos, PC1 y PC2 explicaron el 36,9% y el 18,3% de la varianza de los datos de genotipado y separaron estas muestras en 3 grupos según tres variedades botánicas (subsp. fastigiata var. vulgaris, subsp. fastigiata var. fastigiata y subsp. hipogaea var. hipogaea). Además, los marcadores KASP que contribuyeron principalmente a la variación de PC1 y PC2 fueron B04_84804214, B09_6670331, A01_9265671, A02_65802170 y A05_80673567, A01_90916564 (Tabla complementaria S9). Por otro lado, los dos primeros PC del PCA que utilizaron datos fenotípicos representaron el 28,4% y el 24,1% de la variación fenotípica, y solo separaron de manera bastante aproximada estas muestras en dos grupos (subsp. fastigiata var. vulgaris/var. fastigiata y subsp. hipogaea var. hipogaea). La mayoría de las accesiones de tipo español y valenciano fueron difíciles de distinguir utilizando datos fenotípicos, y la agrupación entre las accesiones de tipo español/Valencia y Virginia/Runner fue menos clara que en el resultado de PCA basado en datos de genotipado (Fig. 4). Los principales rasgos que explican la variación de PC1 y PC2 fueron los días hasta la floración, el nivel de manchas foliares, el rendimiento y el número de vainas (Tabla complementaria S10).

Análisis de componentes principales (PCA) de 282 muestras basado en datos de genotipado de 14 PCR competitivas específicas de alelo (KASP) y datos fenotípicos. Se visualizaron 282 adquisiciones por 4 tipos de mercado, español (SP), Valencia (VA), Virginia (VR), Runner (RN).

Para identificar mejor la estructura de la población dentro de las 282 muestras, se realizó un análisis discriminante de componentes principales (DAPC) basado en un número creciente de grupos (K) asignados por K-medias sucesivas. En tal enfoque, se utilizó el criterio de información bayesiano (BIC) para evaluar la relevancia del modelo, y el resultado mostró que era mejor optar por valores de K de al menos 3 para agrupar las 282 muestras (Figura complementaria S2). De manera similar, se realizó DAPC para 2, 3 y 4 conglomerados para explorar la estructura poblacional de 282 muestras. En K = 2, los conglomerados correspondieron a accesiones de tipo Español/Valencia y Virginia/Runner. En K = 3, los 3 grupos correspondían mayoritariamente a Español, Valencia y Virginia/Runner. En K = 4, la tendencia general de agrupación fue similar a la de K = 3, pero tenía una mezcla de accesiones de las tres variedades botánicas que se asignaron al cuarto grupo (Figura complementaria S3). Este resultado sugirió que nuestros marcadores KASP son efectivos para identificar la estructura poblacional de germoplasma de maní según las variedades botánicas, e incluso puede ilustrar el trasfondo genético similar adquirido por las accesiones correspondientes a una mezcla de variedades botánicas.

Los marcadores moleculares son importantes en muchos aspectos de la genética y el mejoramiento vegetal, incluida la identificación de variedades, la clonación posicional y la exploración de la diversidad genética y la estructura poblacional dentro del germoplasma. El desarrollo de marcadores moleculares en el maní cultivado fue un desafío debido a su estrecha diversidad genética y la alta similitud de secuencia entre sus dos genomas diploides38. Los genomas ensamblados de maní cultivado y sus ancestros diploides utilizando enfoques NGS han impulsado significativamente la investigación genómica en la comunidad del maní. En particular, la secuenciación de representación reducida, como GBS y RAD-seq, se ha utilizado ampliamente en la investigación del maní20,21,22. En este estudio, se utilizó el enfoque RAD-seq para secuenciar 31 muestras de germoplasma taiwanés, descompuestas en un subconjunto "global" que contiene 17 muestras "introducidas" y un subconjunto "local" que contiene 14 muestras taiwanesas, 12 de las cuales son cultivares de élite actuales, 1 siendo una variedad local y 1 siendo una línea de mejoramiento avanzado. El subconjunto global tuvo un número promedio de SNP más alto que el subconjunto local, lo que sugiere que el germoplasma extranjero tenía más polimorfismos que el germoplasma local, y esto puede explicarse por el hecho de que las accesiones del subconjunto global fueron introducidas principalmente desde el Norte y América del Sur abarca la región de origen del maní cultivado domesticado, apoyando la idea de que el origen de los cultivos domesticados acumula una alta diversidad39. Este resultado fue compatible con trabajos previos en soja y sorgo basados ​​en marcadores SSR. De hecho, Iquira et al.40 y Ghebru et al.41 encontraron que la colección de germoplasma con accesiones principalmente del origen de su cultivo tenía más alelos únicos que la otra colección con accesiones de regiones distantes del origen.

Luego se investigó la diversidad genética de estas 31 muestras utilizando varios enfoques basados ​​en 3474 SNP. En conjunto, este panel tuvo un PIC promedio, He esperado, MAF y distancia genética de 0,16, 0,19, 0,87, 0,17 (Tabla 2), respectivamente, lo que concordaba con investigaciones anteriores que utilizaron genotipado SNP42,43,44. Tenga en cuenta que el valor PIC es el nivel de polimorfismo de un marcador. Los marcadores se consideran altamente informativos (superiores a 0,5), razonablemente informativos (0,25-0,5) y sólo ligeramente informativos (inferiores a 0,25) según sus valores PIC29. El PIC promedio de 0,16 de estas 31 accesiones cayó en esta última clase, mientras que el 32% de los SNP identificados correspondieron a la clase razonablemente informativa. En estudios de otras tres colecciones de germoplasma genotipadas mediante matrices de SNP 48 K y 58 K, dos colecciones que comprendían muestras de tres variedades botánicas como este estudio tuvieron un valor PIC medio de 0,1942,44, y la tercera colección de germoplasma, que sólo tenía muestras de dos variedades botánicas variedades, tuvo un valor PIC medio de 0,0843, lo que implica que el panel de germoplasma de 31 accesiones elegidas en este estudio preserva una alta proporción de la diversidad genética general a pesar de un tamaño de muestra más pequeño en comparación con los de estos tres estudios.

Centrándose en los subconjuntos asociados con el origen de nuestro germoplasma, la Tabla 2 mostró que el subconjunto global (n = 17) tenía un valor PIC promedio más alto (0,15) que el subconjunto local (0,14 con n = 14). De manera similar, el He promedio y la distancia genética del subconjunto global (He = 0,19, distancia = 0,17) fueron mayores que los del subconjunto local (He = 0,16, distancia = 0,14), lo que indica que el subconjunto global tenía una mayor diversidad genética que el local. subconjunto. Si bien estas 31 muestras se separaron en tres variedades botánicas, las muestras de la subsp. fastigiata var. fastigiata (tipo Valencia) tenía He (0,18), PIC (0,15) y distancia genética (0,15) mayores en promedio que la subsp. fastigiata var. vulgaris (tipo español, He = 0,13, PIC = 0,11, distancia = 0,11) y subsp. hipogea var. hipogea (tipos Virginia/Runner, He = 0,12, PIC = 0,10, distancia = 0,11). En las 31 accesiones, 11 genotipos eran de la subsp. fastigiata var. fastigiata incluyendo 7 accesiones introducidas, 3 cultivares y 1 variedad local; en particular, 5 de 7 muestras introducidas procedían de países de América del Sur, incluidos Brasil, Uruguay, Perú y Venezuela. El maní cultivado es originario de América del Sur45, por lo que se espera que los genotipos de la subsp. fastigiata var. fastigiata tiene una mayor diversidad genética que los genotipos de subsp. fastigiata var. vulgaris y subsp. hipogea var. hipogaea que compone la mayoría de los cultivares en Taiwán. También se espera que tengan una mayor diversidad que las muestras introducidas en este estudio provenientes de regiones alejadas del centro de origen del maní cultivado.

Las relaciones genéticas entre las 31 muestras se investigaron utilizando la distancia genética por pares para la construcción del dendrograma y el PCA (Tabla complementaria S2). En general, estas 31 muestras se agruparon en tres grupos según tres variedades botánicas. Grupo I y Grupo II con principalmente subsp. fastigiata var. fastigiata y subsp. fastigiata var. vulgaris, respectivamente, estaban separados por una distancia genética de 0,19, y el Grupo III estaba separado del Grupo I/II por una distancia genética de 0,21 (Fig. 1). Estos resultados indicaron que el Grupo I y el Grupo II estaban más estrechamente relacionados entre sí que con el Grupo III, de acuerdo con la clasificación botánica y con otros estudios con tamaños de muestra más grandes12,16,22.

Este resultado del dendrograma también sugirió que los cultivares locales en Taiwán podrían estar sufriendo de una baja diversidad genética debido a la explotación excesiva de recursos genéticos limitados como material de reproducción, en particular genotipos de germoplasma de tipo español (Fig. 1). En el clado principal dentro del Grupo II, hubo 9 accesiones del subconjunto local que contenía 8 cultivares y 1 variedad local. Según el pedigrí de estos 8 cultivares, muchos de ellos eran genéticamente cercanos a TNS9. TNS9 se desarrolló en 1966 mediante selección de línea pura utilizando la línea introducida “Giay” de Vietnam, y esta variedad dominó más del 80% de la producción de maní en Taiwán en la década de 1980 debido a su sabor favorable después del tostado. Esta variedad también ha sido ampliamente explotada en programas de mejoramiento de maní en Taiwán, como el desarrollo de TNG10, HL1, HL2, TN14 y TN18, todos producidos mediante el método de mejoramiento por hibridación. Específicamente, TNS9 fue elegido directamente como padre de HL1 y contribuyó indirectamente al trasfondo genético de las otras cuatro variedades al ser seleccionado como padre de líneas de mejoramiento avanzadas utilizadas en los programas de mejoramiento de estas tres variedades. Con base en la información genealógica, se anticipa que HL2, una variedad tipo Valencia, se agrupó en el grupo con germoplasma mayoritariamente de tipo español. Por otro lado, TN16 y TN17, ambos ricos en antocianinas a base de cianidina en la cubierta de la semilla, son 2 cultivares taiwaneses tipo Valencia derivados de la misma población genética biparental mediante la hibridación de 2 variedades locales recolectadas en el centro de Taiwán. El resultado del dendrograma mostró que TN16 y TN17 estaban agrupados en el Grupo III; además, obviamente estaban separados de las otras accesiones de este clado. Por lo tanto, estas dos variedades no estaban estrechamente relacionadas con los tres grupos que contenían las otras 29 muestras, lo que sugiere que los recursos genéticos potencialmente recolectados localmente aún pueden diversificar el germoplasma taiwanés actual. También se encontró el mismo resultado de agrupamiento utilizando PCA basado en la distancia genética (Fig. 2).

Para comprender la diversidad genética más allá de las 31 muestras, se utilizaron 14 marcadores KASP desarrollados por datos RAD-seq de 31 muestras para evaluar la estructura poblacional de 282 muestras de maní del centro de conservación de germoplasma en TARI. Por otro lado, también consideramos los datos fenotípicos como una herramienta alternativa para la evaluación de la estructura poblacional; Específicamente, se evaluaron 8 rasgos cuantitativos agronómicos en la prueba de campo en el otoño de 2016 utilizando 306 muestras, incluidas 282 muestras de maní para la validación del marcador KASP y 24 de 31 muestras utilizadas en RAD-seq.

Los resultados del fenotipado coincidieron con ensayos de campo similares realizados en India y Turquía, que separaron la subsp. fastigiata y subsp. hipogea en dos grupos46,47. De manera similar a los resultados de dos estudios anteriores, encontramos que la subsp. Las accesiones de fastigiata en Taiwán tenían características de madurez temprana. Sin embargo, nuestro trabajo demostró que la subsp. fastigiata tienen más vainas de las reportadas anteriormente, sus características relacionadas con el rendimiento indicaron que la subsp. Las accesiones fastigiata producen mayores rendimientos que las subsp. accesiones de hipogaea en Taiwán (Tabla complementaria S4). Este resultado puede explicarse por el clima de Taiwán, que influye en la estrategia de mejoramiento del maní. En términos de zonas climáticas, Taiwán está dividida en la parte norte que pertenece a la zona climática subtropical y la parte sur que pertenece a la zona climática tropical, lo que permite a los agricultores tener anualmente dos temporadas de cultivo. Sin embargo, la temporada de “lluvia de ciruela” entre mediados de mayo y mediados de junio y los tifones que ocurren entre junio y octubre pueden dañar gravemente el rendimiento del maní al final de la primera temporada de cultivo o al comienzo de la segunda, respectivamente. Por lo tanto, los mejoradores de maní taiwaneses han elegido accesiones de maní con características de madurez temprana, especialmente maní de tipo español, como materiales de mejoramiento, lo que refleja el resultado del Cuadro complementario S4 de que las accesiones de tipo español tienen más vainas que las accesiones de otros tres tipos de mercado. Para los análisis de PCA basados ​​en datos fenotípicos, no se pudieron distinguir las 24 muestras utilizadas en RAD-seq, y las 282 muestras utilizadas para la validación de KASP se agruparon en dos grupos principalmente según la subsp. fastigiata y subsp. hipogea (Fig. 4, Fig. Suplementaria S1). En el PCA de las 282 accesiones, los rasgos que desempeñaron los papeles más importantes en PC1 y PC2 fueron los días hasta la floración, el nivel de resistencia a las manchas foliares, el rendimiento y el número de vainas, lo que coincide con rasgos que tienen diferencias significativas entre dos subespecies de maní (Tablas complementarias S4 , S10).

Si bien validamos estos marcadores KASP utilizando 282 genotipos, los resultados de PCA mostraron que estos genotipos se separaron claramente en 3 grupos según tres variedades botánicas (Fig. 4). Esta conclusión también fue respaldada por la agrupación de K-medias, en particular con la elección K = 3; más allá de ese valor, el valor BIC no mejoró mucho (Figura complementaria S2). Además, estos marcadores KASP distinguían claramente la subsp. fastigiata y subsp. accesiones de hipogaea en K = 2, y luego se separaron var. fastigiata y var. vulgaris de la misma subespecie fastigiata en K = 3, lo cual fue compatible con trabajos anteriores22. Sin embargo, cuando se estableció K = 4, el grupo adicional tenía una mezcla de cuatro tipos comerciales de germoplasma pertenecientes a las tres variedades botánicas, lo que sugiere que pueden haber ocurrido intercambios de antecedentes genéticos entre estas muestras. Este resultado de un cuarto grupo que no corresponde a subespecies o tipos de mercado también se informó en otros trabajos12,42, y puede deberse a dificultades en el fenotipado48,49. En ambos conjuntos, que contienen respectivamente 31 y 282 muestras, se utilizó PCA para comparar la efectividad de los marcadores moleculares y los datos fenotípicos con muestras agrupadas, y se demostró que el PCA basado en marcadores moleculares proporciona resultados más reproducibles y satisfactorios que el PCA basado en datos fenotípicos. (Figs. 2, 4, Fig. Suplementaria S1).

En general, los SNP identificados mediante el enfoque RAD revelaron la diversidad genética y la relación entre el germoplasma de maní en Taiwán. Nuestros análisis sugieren que se debería ampliar la diversidad genética mediante la introducción de germoplasma nuevo para prevenir la vulnerabilidad genética. Además, los marcadores KASP desarrollados con éxito aquí podrían ser herramientas útiles para identificar la estructura poblacional de otras colecciones de germoplasma de maní o para realizar más estudios genéticos relacionados con el mejoramiento.

Los datos de secuenciación de 31 muestras producidas en este estudio se han depositado en NCBI BioProject PRJNA811600. Todos los códigos relacionados con este proyecto están disponibles en el sitio de github https://github.com/ymhsu/ahdivertwn.

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Agradecemos a OC Martin, T. Blein y KH Chen por las discusiones. Los autores también agradecen al Dr. KY Chen de la Universidad Nacional de Taiwán por proporcionar recursos y a CY Liu por la orientación mientras preparaban las bibliotecas RAD-seq.

Esta investigación fue financiada con fondos del Consejo de Agricultura de Taiwán (ID de proyecto: 105AS-9.3.1-CI-C3 y 106AS-8.2.1-CI-C3). El trabajo de YM. Hsu contó con el apoyo de una beca de doctorado otorgada por el Ministerio de Educación (Taiwán) y la Universidad Paris-Sud/Saclay. IPS2 cuenta con el apoyo de Saclay Plant Science-SPS (ANR-17-EUR-0007).

Universidad Paris-Saclay, CNRS, INRAE, Univ Evry, Instituto de Ciencias Vegetales Paris-Saclay (IPS2), 91405, Orsay, Francia

Yu Ming Hsu

Universidad Paris Cité, CNRS, INRAE, Instituto de Ciencias Vegetales Paris-Saclay (IPS2), 91405, Orsay, Francia

Yu Ming Hsu

División de Ciencias de Cultivos, Instituto de Investigación Agrícola de Taiwán, Taichung, 413008, Taiwán, República de China

Yu-Ming Hsu, Shin-Ruei Lee, Hsiang Fang, Wei-Chia Hung y Hung-Yu Dai

División de Mejoramiento de Cultivos, Estación de Extensión e Investigación Agrícola del Distrito de Tainan, Tainan, 71246, Taiwán, República de China

Sheng-Shan Wang

Departamento de Agronomía, Universidad Nacional de Chiayi, Chiayi, 60004, Taiwán, República de China

Yu-Chien Tseng y Hsin-I. kuo

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HYD y SSW concibieron el estudio y obtuvieron la financiación. YMH diseñó el proceso de análisis de datos y bioinformática y escribió el manuscrito. SRL, HF, WCH y HIK realizaron los experimentos. YCT supervisó al estudiante. Todos los autores contribuyeron a las revisiones del manuscrito.

Correspondencia a Hung-Yu Dai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Hsu, YM., Wang, SS., Tseng, YC. et al. Evaluación de la diversidad genética y el desarrollo de marcadores SNP en germoplasma de maní en Taiwán mediante RAD-seq. Informe científico 12, 14495 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18737-0

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Recibido: 17 de marzo de 2022

Aceptado: 18 de agosto de 2022

Publicado: 25 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18737-0

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